2026年 07期
流式细胞术分选小鼠肿瘤髓源性抑制细胞的方案优化及鉴定
杜佳;饶路路;侯昕;马旸;目的 优化小鼠Lewis肺癌(LLC)皮下肿瘤组织中髓源性抑制细胞(MDSC)的流式分选流程，提升单细胞制备效率和分选纯度，为后续功能研究提供高质量细胞来源。方法 取C57BL/6小鼠皮下LLC肿瘤组织，首先比较2种酶学消化体系对单细胞制备效果的影响。经死活染料(Live/Dead)及抗小鼠CD45、CD11b、Gr-1抗体标记后，上样至Beckman CytoFLEX流式细胞分选仪。其次采用常规与优化2种设门策略，优化策略以CD45+细胞群为起始门直接圈定MDSC富集区域，后续筛选CD11b~+Gr-1+细胞。最后通过流式细胞术检测纯度，台盼蓝染色检测活率，并以RT-qPCR分析MDSC特征基因Arg1、Nos2、IL-10、S100A8/A9的表达。结果 优化的消化体系显著提高单细胞数量及活率。优化圈门策略后，分选阳性率显著提升。Arg1、Nos2、IL-10及S100A8/A9基因在分选细胞中高表达，提示分选后细胞保持MDSC特征性功能。结论 该研究通过优化“组织消化体系和流式设门策略”，建立了高效分离肿瘤组织MDSC的流程，在保证抗原结构完整的同时提高了单细胞制备得率与纯度，为后续MDSC功能与代谢研究提供可靠的方法学基础。
一种基于OX40L胞内域的靶向IL-13Rα CAR巨噬细胞的构建与验证
薛慧;薛梓萌;陈维乐;邱佳琪;朱梦娟;陈义昭;涂佳杰;目的 构建靶向白细胞介素-13受体α(IL-13Rα)且胞内域整合可双重激活巨噬细胞与T细胞的信号接头蛋白OX40L的嵌合抗原受体巨噬细胞(CAR-M)。方法 设计并合成以OX40L为胞内信号域、靶向IL-13Rα的CAR分子(IL-13Rα-OX40LCAR)，将其定向克隆至腺病毒表达载体。采用佛波酯诱导THP-1细胞分化为巨噬细胞(THP-1-M)后，用重组腺病毒感染该细胞，构建稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)标记的anti-IL-13Rα CAR的THP-1巨噬细胞。通过流式细胞术监测CAR分子的表达效率；以空载体组为阴性对照、CD3ζ组为阳性对照、OX40L-CD3ζ组为实验组，通过体外共培养实验，检测各组巨噬细胞对IL-13Rα高表达胶质瘤细胞(U251)及低表达胶质瘤细胞(T98G)的吞噬功能差异。结果 CAR腺病毒高效率转染THP-1-M，获得anti-IL-13Rα CAR-M。与不同IL-13Rα表达水平的胶质瘤细胞共培养后，流式细胞术结果显示，对于低表达IL-13Rα的T98G细胞，三组间差异无统计学意义；在与IL-13Rα高表达的U251细胞共培养后，与空载体组相比，CD3ζ组表现出增强的吞噬作用(P<0.05)，与CD3ζ组相比，OX40L-CD3ζ组吞噬能力进一步增强(P<0.05)。结论 通过构建IL-13Rα-OX40L-CAR腺病毒并转染经PMA诱导分化的THP-1-M，成功构建了anti-IL13Rα-OX40L-CAR-M，且其能通过特异性靶向吞噬高表达IL-13Rα的胶质瘤细胞，并表现出优于传统CD3ζ胞内域的激活。
破壁灵芝孢子粉通过调控Nrf2通路保护DEN/CCl4诱导的小鼠肝癌模型
金海;万硕;刘倩;赵思宇;李婧;朱加兴;安家兴;金凤;目的 研究破壁灵芝孢子粉(GLS)对小鼠肝癌模型的治疗作用并探索其机制。方法 将50只2周龄C57BL/6J小鼠分为对照组、模型组及GLS低、中、高剂量(0.25、0.5、1.0 g/kg)组，每组10只，建立二乙基亚硝胺(DEN)/CCl4小鼠肝癌模型，第8周开始灌胃GLS，每天1次，连续14周。末次给药结束后观察小鼠肝脏结节数量，酶联免疫吸附测定法检测小鼠血清甲胎蛋白(AFP)；钼酸铵法检测小鼠血清、肝组织过氧化氢酶(CAT)含量；微板法检测小鼠血清、肝组织还原型谷胱甘肽(GSH)含量；比色法检测小鼠血清、肝组织谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)含量；免疫组化法检测增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达；实时荧光定量聚合酶链式反应检测核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素加氧-1(Ho-1)、Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)、醌氧化还原酶1(Nqo1)和谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基(Gclc)mRNA相对表达。结果 与对照组比较，模型组小鼠血清AFP含量升高(P<0.01)，小鼠肝脏及血清CAT、GSH、GSH-PX含量下降(P<0.01),Keap1、Nqo1 mRNA相对表达升高(P<0.01),Nrf2、Ho-1、Gclc mRNA相对表达降低(P<0.01),PCNA阳性表达率升高(P<0.01)；与模型组比较，给药组小鼠肝脏结节总数、血清AFP含量降低(P<0.01)，小鼠肝脏及血清CAT、GSH、GSH-PX含量升高(P<0.05或P<0.01),Keap1、Nqo1 mRNA表达降低(P<0.05),Nrf2、Ho-1、Gclc mRNA表达升高(P<0.05),PCNA阳性表达率降低(P<0.01)。结论 GLS对DEN/CCl4诱导的小鼠肝癌模型具有显著保护作用，作用机制与调节小鼠肝脏氧化应激有关。
4-苯基丁酸改善脂多糖引起的母鼠胆汁酸代谢紊乱
梁心茹;孙影;暴双蕊;詹童;吴红艳;陶文康;张伦;王建青;张程;目的 探讨内质网应激(ERS)抑制剂4-苯基丁酸(4-PBA)对细菌脂多糖(LPS)诱导的妊娠晚期小鼠胆汁酸代谢紊乱的改善作用，阐明ERS在妊娠期肝内胆汁淤积症(ICP)中的调控机制。方法 将24只孕鼠随机分为对照组、LPS组、4-PBA组及LPS+4-PBA组。LPS组于妊娠第16天腹腔注射LPS(200μg/kg),4-PBA组腹腔注射4-PBA(150 mg/kg),LPS+4-PBA组在腹腔注射4-PBA(150 mg/kg)后1 h再腹腔注射LPS(200μg/kg)。所有孕鼠在LPS处理后6 h检测血清总胆汁酸(TBA)、肝损伤标志物、胆汁酸谱及其关键基因和蛋白表达。结果 LPS暴露升高孕鼠血清TBA水平(P<0.05)，激活ERS标志物及炎症因子，并下调胆汁酸转运蛋白和合成限速酶CYP7A1的表达(均P<0.05)。4-PBA干预有效抑制ERS，降低TBA水平(P<0.05)，并上调Ntcp、Bsep、Mdr3及Mrp3基因表达(均P<0.05)。结论 ERS在LPS干扰妊娠期胆汁酸代谢稳态中发挥重要作用，抑制ERS可通过调控胆汁酸转运蛋白改善胆汁淤积，为ICP的靶向治疗提供理论依据。
激活α7nAChR优化肥胖小鼠棕色脂肪组织产热
田文成;王苏童;范和松;李颜;姜萍;李晓;目的 探索激活α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7nAChR)优化肥胖小鼠棕色脂肪组织(BAT)产热作用机制。方法 采用高脂饮食诱导肥胖模型，50只8周龄C57BL/6J小鼠随机分为低脂饮食组(Control组)、高脂饮食组(HFD组)、高脂饮食+β3受体激动剂组(HFD+β3组)、高脂饮食+β3受体激动剂+α7nAChR选择性激动剂组(HFD+β3+GTS-21组)、高脂饮食+β3受体激动剂+α7nAChR选择性抑制剂组(HFD+β3+α-BGT组)。苏木精-伊红(HE)染色观察BAT的形态结构，透射电子显微镜分析脂肪细胞内线粒体数量及脂滴形态变化；ELISA检测BAT中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-10、转化生长因子β(TGF-β)、环磷酸腺苷(cAMP)以及去甲肾上腺素(NE)水平；RT-qPCR检测BAT中血管内皮生长因子(VEGF-A)、一氧化氮合酶2(NOS2)、精氨酸酶1(Arg1) mRNA的表达水平、以及解偶联蛋白1(UCP1)、含PR结构域蛋白16(PRDM16)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(PGC-1α)表达水平；免疫组织化学方法检测棕色脂肪中的CD31、CD86和CD206等巨噬细胞标志物的表达；Western blot检测UCP1、α7nAChR、核因子κB p65(NF-κB p65)、磷酸化Janus激酶2(p-JAK2)和磷酸化信号转导及转录激活因子3(p-STAT3)水平。结果 与Control组比较，HFD组脂肪细胞中脂滴面积增大、线粒体数量减少，促炎因子TNF-α、IL-1β上调，抑炎因子IL-10、TGF-β及Arg1、VEGF-A下调(均P<0.01)。与HFD+β3组相比，HFD+β3+GTS-21组脂肪细胞中脂滴面积减小，线粒体数量增加，促炎因子TNF-α、IL-1β、NOS2及NF-κB p65表达下降，抑炎因子IL-10、TGF-β及Arg1、p-STAT3、pJAK2磷酸化水平升高(均P<0.01)。结论 激活α7nAChR联合β3受体激动剂可有效促进产热反应，改善脂肪组织局部低氧，使局部炎症相关表型向M2样表型偏移，从而缓解BAT炎症状态，增强其产热能力。
机械敏感离子通道Piezo1在结膜松弛症中的表达
夷成龙;陶霓霞;杨灿;赵怡;项敏泓;目的 旨在观察球结膜成纤维细胞中Piezo1的表达是否参与结膜松弛症(CCH)的发生发展。方法 采用组织块贴壁法获得CCH患者和正常对照组(NC)的原代球结膜成纤维细胞，纯化后行结膜成纤维细胞鉴定。免疫组化检测NC组和CCH组球结膜组织中Piezo1的表达情况。免疫荧光检测CCH组和NC组球结膜成纤维细胞中Piezo1的表达情况，以及Piezo1激动剂Yoda1干预后基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达情况。qRT-PCR检测CCH组和NC组中Piezo1与MMP-9的mRNA表达情况，以及Yoda1干预后MMP-9的mRNA表达情况。此外，Yoda1干预后采用共聚焦显微镜检测NC组球结膜成纤维细胞中Ca2+内流情况；Yoda1干预后膜片钳检测NC球结膜成纤维细胞的电流幅度，验证Piezo1功能性表达。结果 成功培养原代球结膜成纤维细胞。免疫组化发现CCH组中Piezo1蛋白表达升高(P<0.01)。qRT-PCR检测发现：相较于NC组，CCH组中Piezo1的mRNA表达升高(P<0.01),MMP-9的mRNA表达升高(P<0.01)；相较于CCH组，CCH+Yoda1组MMP-9的mRNA表达升高(P<0.01)。免疫荧光检测Piezo1发现CCH组相对于NC组细胞膜上的荧光增强(P<0.05)，加入Yoda1刺激后MMP-9的荧光较CCH组增强(P<0.05)。NC组球结膜成纤维细胞加入Yoda1后，共聚焦显微镜显示Piezo1的荧光增强(P<0.05)；膜片钳检测NC组球结膜成纤维细胞加入Yoda1后激活的电流幅度增强(P<0.000 1)。结论 CCH中结膜组织产生的机械损伤上调了Piezo1的表达，而Piezo1的激活可能放大了CCH造成的机械性损伤。
低氧环境对抗肿瘤药物培美曲塞介导的肿瘤细胞凋亡的影响
周文静;葛若木;王子涵;江小丽;钟健;何清雅;张胜权;张素梅;目的 研究低氧环境对培美曲塞(PE)介导的非小细胞肺癌细胞凋亡的影响。方法 将A549细胞置于21%O2或1%O2中，给予8μmol/L PE处理48 h，分为常氧对照组、常氧溶剂组、常氧加药组、低氧对照组、低氧溶剂组、低氧加药组。台盼蓝染色法检测低氧环境与常氧环境下的细胞给予PE处理后的死亡情况；流式细胞术检测PE作用后常氧和低氧环境下细胞的凋亡率；细胞划痕实验检测PE作用后常氧和低氧环境下细胞的迁移距离；Western blot检测MRP-1、Cleaved Caspase-3、E-Cadherin、N-Cadherin表达。结果 台盼蓝染色结果显示，与常氧加药组相比，低氧环境下PE作用后的细胞死亡率下降(P<0.001)。流式细胞术结果显示，低氧和常氧环境下PE均导致细胞凋亡，但常氧加药组凋亡率显著高于低氧加药组(P<0.000 1)。细胞划痕实验结果显示，常氧和低氧环境下PE处理24 h和48 h后，A549细胞的迁移距离均小于对照组细胞(P<0.05)，但常氧加药组和低氧加药组细胞的迁移距离无显著性差异。Western blot结果显示，低氧环境下PE处理的细胞中MRP-1表达明显高于常氧环境下PE处理的细胞(P<0.000 1)。与对照组比较，常氧条件下，PE作用于A549细胞后，Cleaved Caspase-3的表达上升(P<0.05)，但低氧条件下，PE处理的细胞中Cleaved Caspase-3表达无明显变化。低氧和常氧环境下，PE处理的细胞中E-Cadherin表达下降(P<0.000 1、P<0.001),N-Cadherin表达降低(P<0.05、P<0.000 1)，但低氧加药处理的细胞中E-Cadherin和NCadherin表达明显低于常氧加药组(均P<0.000 1)。结论 低氧可显著削弱PE对A549细胞的促凋亡效应，并阻断Cleaved Caspase-3激活；其机制可能与低氧诱导MRP-1高表达、减少药物蓄积有关。干预MRP-1或恢复凋亡通路活性可能成为克服低氧耐药的新策略。
信号素3A促进病理性心肌肥厚的实验研究
武栗妃;张姣姣;张星;李东航;王宏波;曹济民;目的 探讨信号素3A(Sema3A)对病理性心肌肥厚进展的影响。方法 使用野生型C57BL 6J小鼠、Sema3A全身性过表达(Sema3A/Cre-ERTM)小鼠及同窝对照(Cre-ERTM)小鼠，每组6只。采用主动脉弓缩窄术(TAC)建立心肌肥厚模型，并设假手术组(Sham)作为对照。通过大体表型、心重/体质量比(HW/BW)、心重/胫骨长度比(HW/HL)和心重/肺重比(HW/PW)评估心脏肥厚程度。通过小动物超声检测射血分数(EF)和短轴缩短率(FS)评价心功能。心脏组织分别通过RT-qPCR检测心房钠尿肽(ANP)和Sema3A mRNA的表达，Western blot检测Sema3A蛋白水平，苏木精-伊红染色观察形态结构，马松染色分析纤维化程度，免疫组化检测CD31以评估血管新生。离体实验采用大鼠H9C2以血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)诱导肥大，对照组用PBS处理。48 h后通过RT-qPCR检测ANP、B型钠尿肽(BNP)及Sema3A mRNA表达，Western blot检测Sema3A蛋白水平。结果 在动物整体水平，与Sham组相比，野生型C57 BL 6J小鼠在TAC术后其心脏组织ANP的mRNA水平显著升高，Sema3A的mRNA和Sema3A蛋白水平也明显升高(均P<0.05)；与Cre-ERTM+TAC组小鼠相比，Sema3A/Cre-ERTM+TAC组小鼠心脏肥大、HW/BW、HW/HL和HW/PW及心室壁增厚均更为显著，EF及FS降低更为明显，心脏纤维化程度更为严重，心脏CD31的表达水平减少(均P<0.05)。在细胞水平，与对照组相比，H9C2细胞给予Ang Ⅱ处理后其ANP和BNP的mRNA水平升高，Sema3A的mRNA和Sema3A蛋白水平也升高(均P<0.05)。结论 Sema3A可通过抑制血管新生而促进压力负荷性心肌肥厚的进展。
B细胞条件性敲除Spi1基因小鼠的构建及基因型鉴定
葛锐麟;张慧茹;薛梓萌;涂佳杰;目的 构建B细胞条件性敲除Spi1基因小鼠并分析其基因型，为疾病病理机制及药物靶点研究提供动物模型基础。方法将Mb1-cre转基因小鼠与Spi1flox/flox小鼠进行杂交繁育，通过PCR和琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型，筛选出基因型Mb1-cre×Spi1flox/flox的纯合敲除小鼠；采用流式细胞术检测各免疫细胞亚群中PU. 1蛋白表达，验证基因敲除特异性。结果 PCR法鉴定结果显示，采用flox引物鉴定时仅扩增出220 bp条带，即基因型为Spi1flox/flox小鼠，采用Mb1-Cre引物鉴定时扩增出383 bp条带，即基因型为Mb1-cre×Spi1flox/flox小鼠；流式细胞术结果显示，与Spi1flox/flox小鼠相比，Mb1-cre×Spi1flox/flox小鼠骨髓来源单个核细胞、外周血单个核细胞和脾脏来源的B细胞中PU. 1表达水平显著降低，且PU. 1在其他免疫细胞内(如CD4~+T和巨噬细胞)正常表达。结论 该研究借助Cre/LoxP系统以及CRISPR/Cas9技术，成功构建出B细胞条件性敲除Spi1基因的小鼠，为深入探究PU. 1在B细胞相关疾病里的具体作用提供了可靠的动物模型。
移动流行区间法在安徽省冬春季流感流行阈值估计与强度分级中的应用
朱标;朱梦;龚磊;李淑雯;吴家兵;朱青青;目的 利用移动流行区间法(MEM)探索建立安徽省流行性感冒预警方法，为安徽省流感防控工作提供科学的参考依据。方法 基于流感哨点监测医院和网络实验室每周在“中国流感监测信息系统”中上报的监测数据，分析全省每周流感病毒检测阳性率(PR)，利用MEM分别估计新冠疫情前后安徽省冬春季流感流行阈值与分级强度阈值，采用交叉验证法对MEM预警效果进行评价。结果 通过PR和MEM获得流感流行阈值与分级强度阈值，新冠疫情前流感流行开始阈值、中强度阈值、高强度阈值、极高强度阈值和结束阈值分别为17.08%、38.47%、53.20%、59.71%和12.34%；此时模型的灵敏度为0.98、特异度为0.86、马修斯相关系数为0.84、约登指数为0.84。新冠疫情后流感流行开始阈值、中强度阈值、高强度阈值、极高强度阈值和结束阈值分别为25.61%、43.81%、63.29%、74.46%和17.82%；此时模型的灵敏度为0.86、特异度为0.92、马修斯相关系数为0.78、约登指数为0.77。结论 MEM在安徽省冬春季流感流行阈值与分级强度阈值估计中的应用效果较好，新冠疫情后的流感流行阈值与分级强度阈值高于新冠疫情前。