2025年 06期
TREM2基因敲除小鼠的构建、繁育和基因鉴定
黄蓉;赵鑫鑫;薛慧;朱梦娟;涂佳杰;王鑫铭;目的 采用CRISPR/Cas9技术构建髓细胞触发受体2(TREM2)基因敲除(TREM2-/-)小鼠，繁育TREM2-/-小鼠并分析其基因型。方法 采用CRISPR/Cas9技术选择性敲除TREM2基因的外显子2～3区域，构建TREM2-/-小鼠模型，所有小鼠的遗传背景均为C57BL/6J。采用聚合酶链式反应(PCR)法鉴定小鼠的基因型。实时荧光定量PCR(qPCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测小鼠主要组织中TREM2的表达水平，从mRNA水平和蛋白水平上验证PCR鉴定结果的真实性以及科学性。根据sgRNA序列在CCTop网站预测出可能存在的脱靶位点，提取小鼠尾部DNA经PCR扩增后进行Sanger测序，检测TREM2-/-小鼠有无产生脱靶效应。结果 通过CRISPR/Cas9技术成功构建了TREM2-/-小鼠，并对小鼠进行了基因型鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果显示，仅扩增出415 bp条带的小鼠基因型为野生型(WT);仅扩增出449 bp条带的小鼠基因型为TREM2-/-;扩增出415 bp和449 bp双条带的小鼠基因型为杂合型。qPCR结果显示，与WT小鼠相比，TREM2-/-小鼠的心脏、脑组织中TREM2的mRNA表达水平均下调(P<0.01),胸腺、肺组织中TREM2的mRNA表达也呈现下降趋势(P<0.05)。Western blot结果显示，与WT小鼠相比，TREM2-/-小鼠的心脏、脑、胸腺、肺组织以及外周血单个核细胞(PBMC)中TREM2的蛋白表达水平均降低(P<0.01)。Sanger测序结果表明TREM2-/-小鼠没有产生脱靶效应。结论 成功构建并繁育了TREM2-/-小鼠，建立了一种可靠的基因型鉴定方法，并采用qPCR、Western blot以及Sanger测序分析，验证了小鼠模型遗传的稳定性，将为TREM2基因功能的研究提供重要的基因动物模型。
铁皮石斛多糖通过激活Nrf2/HO-1通路改善新生小鼠坏死性小肠结肠炎的肠道损伤
王静;吴铭;王军;目的 探究铁皮石斛多糖(DOP)对新生小鼠坏死性小肠结肠炎(NEC)的改善作用并初步分析其可能的分子机制。方法 60只7 d龄C57BL/6J小鼠分为四组：对照(CTRL)组、坏死性小肠结肠炎(NEC)组、DOP低剂量治疗(DOPL+NEC)组以及DOP高剂量治疗(DOPH+NEC)组。采用低氧、冷刺激、高渗喂养以及腹腔注射脂多糖(LPS)法建立NEC模型，实验结束后取小肠组织。观察小鼠一般情况，并整理分析小鼠体质量；苏木精-伊红(HE)染色观察小肠组织病理改变；免疫组化和Western blot检测小肠组织钙黏蛋白E(E-cadherin)、闭锁蛋白(Occludin)和紧密连接蛋白1(Claudin-1)的表达水平；ELISA检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6和IL-10的表达水平；试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和还原型谷胱甘肽(GSH)含量；免疫组化和Western blot检测核因子红细胞2相关因子2(Nrf2)和血红素氧合酶1(HO-1)蛋白的表达水平。结果 与CTRL组相比，NEC组小鼠体质量下降、HE病理评分增加(P<0.01或P<0.001);E-cadherin、Occludin和Claudin-1蛋白表达减少(P<0.01或P<0.001);TNF-α、IL-1β、IL-6浓度升高，IL-10浓度降低(P<0.01);MDA、LDH含量升高，GSH、SOD含量减少(P<0.01);Nrf2、HO-1蛋白表达增加(P<0.05或P<0.01)。而DOP干预后，与NEC组相比，小鼠体质量增加、HE评分降低(P<0.05或P<0.01);E-cadherin、Occludin、Claudin-1蛋白表达增加(P<0.05或P<0.01或P<0.001);TNF-α、IL-1β、IL-6浓度降低(P<0.05或P<0.01),IL-10浓度升高(P<0.01);MDA、LDH含量减少，GSH、SOD含量增加(P<0.05或P<0.01);Nrf2、HO-1蛋白表达进一步增加(P<0.05或P<0.01)。结论 DOP可以改善NEC小鼠的肠道病理损伤和肠道黏膜屏障功能，降低NEC小鼠氧化应激损伤和肠道炎症，其作用可能与DOP激活Nrf2/HO-1通路有关。
C1GALT1在胶质母细胞瘤中的表达和生物学作用
敖欣;龙云峰;张峥嵘;张明珠;乐壮;苏延停;目的 探究核心1β1,3-半乳糖基转移酶1(C1GALT1)在胶质母细胞瘤(GBM)中的表达及其对GBM发生发展的影响。方法 利用GEPIA和CGGA数据库分析C1GALT1在GBM中的表达水平及预后情况。选择两种代表性的GBM细胞(U251和LN18),构建敲低C1GALT1的GBM细胞系并进行体外实验。细胞计数试剂盒8(CCK-8)法、Transwell实验检测C1GALT1对GBM细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响。转录组数据分析可能的信号通路。采用细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测细胞β-半乳糖苷酶活性。结果 GEPIA和CGGA数据库分析结果显示，与癌旁组织相比，C1GALT1在GBM组织中高表达(P<0.05),其高表达与患者不良预后相关(P<0.000 1)。CCK-8实验结果显示敲低C1GALT1后，细胞的增殖能力下降(P<0.05)。Transwell实验结果显示敲低C1GALT1后细胞迁移和侵袭能力降低(P<0.001)。转录组测序和细胞衰老β-半乳糖苷酶染色实验结果显示C1GALT1参与到细胞衰老信号通路，敲低C1GALT1后细胞衰老相关的β-半乳糖苷酶活性明显增强(P<0.05)。结论 C1GALT1在GBM组织中高表达，并可能通过抑制细胞衰老增强GBM细胞的增殖、迁移和侵袭能力。
沉默circFADS2通过miR-152-3p/SLC7A11信号轴诱导结直肠癌细胞铁死亡
蒋良君;卢先州;目的 探讨沉默circFADS2对结直肠癌(CRC)细胞铁死亡的影响及其机制。方法 以人结肠腺癌细胞系SW480作为研究对象，分别将circFADS2 siRNA干扰质粒(si-circFADS2)及其阴性对照si-NC、miR-152-3p inhibitor及其阴性对照inhibitor-NC、miR-152-3p mimics及其阴性对照mimics NC、SLC7A11过表达质粒(oe-SLC7A11)及其阴性对照vector转染至SW480细胞中，噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活性；化学法检测细胞中亚铁离子(Fe2+)、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)活性水平；二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)探针法检测细胞中活性氧(ROS)水平；实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)检测细胞中miR-152-3p和SLC7A11 mRNA表达水平；Western blot检测细胞中铁死亡相关蛋白SLC7A11、GPX4表达水平；双荧光素酶报告基因实验验证miR-152-3p与circFADS2之间的海绵吸附关系，以及miR-152-3p与SLC7A11之间的靶向调控关系。结果 与blank组比较，si-circFADS2组细胞增殖活性降低，细胞中Fe2+、MDA和ROS水平升高，SOD和GSH水平降低；同时，细胞中miR-152-3p表达水平升高，SLC7A11和GPX4蛋白表达水平降低(均P<0.05)。与si-circFADS2组比较，si-circFADS2+inhibitor组细胞增殖活性升高，细胞中Fe2+、MDA和ROS水平降低，SOD和GSH水平升高；同时，细胞中miR-152-3p表达水平降低，SLC7A11和GPX4蛋白表达水平升高(均P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验结果显示，SLC7A11是miR-152-3p的下游靶基因。结论 沉默circFADS2可诱导CRC细胞铁死亡，其机制可能是通过靶向调控miR-152-3p/SLC7A11信号轴实现的。
聚苯乙烯微塑料诱导氧化应激和铁死亡致小鼠心肌损伤作用
黄琪;朱德育;梁潇;吴金铃;覃文桂;马萍;武阳;鲍翠玉;目的 探讨聚苯乙烯微塑料(PS-MPs)诱导小鼠心肌损伤作用及其分子机制。方法 60只C57BL/6雄性小鼠随机分为生理盐水组，0.1、1、10 mg/kg PS-MPs暴露组，阿霉素[DOX 5 mg/(kg·w)]组；处理8周。处理结束后测定各组小鼠血压、心脏脏器系数、心脏组织病理学改变、心脏组织中氧化应激标志物活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、4-羟基壬烯醛(4-HNE)和核因子E2相关因子2(Nrf2)水平，以及血清中心肌损伤标志物肌酸激酶MB(CK-MB)和肌钙蛋白T(cTnT)、铁死亡标志物重组谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、重组溶质载体家族7(SLC7A11)及亚铁离子(Fe2+)水平。结果 与阴性对照组相比，PS-MPs暴露后小鼠心脏可见明显的空泡化、炎症浸润及胶原纤维沉积；心肌损伤标志物CK-MB、cTnT指标水平升高；心脏脏器系数降低、血压升高、氧化应激标志物及铁死亡标志物水平升高。结论 PS-MPs暴露可以诱导氧化应激，并激活铁死亡途径，导致小鼠心肌损伤。
IL-9RCDS基因人源化小鼠模型构建与验证
刘崇;周园园;薛慧;薛梓萌;陈维乐;涂佳杰;目的 构建白细胞介素9受体(IL-9R)编码序列(CDS)基因人源化小鼠模型，验证小鼠基因型和IL-9R表达。方法 采用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，将小鼠胚胎干细胞的il-9r基因的exon 2-7片段替换为相应人源IL-9R。琼脂糖凝胶电泳法验证基因片段替换完成后，构建四倍体胚胎，并通过显微注射法送回到代孕鼠输卵管中，经母鼠代孕，获得纯合人源化小鼠。提取IL-9R CDS基因人源化纯合小鼠DNA,经过PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳鉴定其基因型，Western blot检测IL-9R基因人源化纯合小鼠脾脏及胸腺中的IL-9R表达。结果 PCR扩增后凝胶电泳结果显示，采用WT引物鉴定时仅扩增出1 805 bp条带的小鼠基因型为野生型，采用5KI、3KI引物鉴定时扩增出2 553、2 340 bp条带的小鼠，即为IL-9R CDS基因人源化纯合小鼠；Western blot结果显示，IL-9R CDS基因人源化纯合小鼠的组织表达IL-9R。结论 成功构建和鉴定IL-9R CDS基因人源化小鼠模型。
miR-224-5p对人肝癌细胞HepG2增殖、凋亡、侵袭及迁移的作用机制
顾铃毓;王利新;崔洁;董辉;目的 探讨miR-224-5p对人肝癌细胞HepG2细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的作用机制。方法 从TCGA数据集获取肝细胞癌患者中miR-224-5p和早期生长反应因子2(EGR2)的RNA表达水平；体外培养人正常肝细胞LO2和肝癌细胞HepG2细胞，并在HepG2细胞中转染慢病毒载体(敲低miR-224-5p)、小干扰RNA片段或过表达载体(干扰及过表达EGR2)。实时荧光定量PCR实验(qPCR)检测肝癌cDNA芯片及细胞中miR-224-5p及EGR2的RNA表达水平；Western blot检测细胞中EGR2蛋白表达水平；双荧光素酶报告基因实验检测miR-224-5p与EGR2结合情况；EdU实验检测HepG2细胞阳性率，流式细胞术检测细胞凋亡率，Transwell实验检测细胞侵袭数，划痕实验检测细胞迁移率。结果 与癌旁组织相比，HCC组织中miR-224-5p表达升高，EGR2 mRNA水平表达下降；与LO2组细胞相比，HepG2细胞中miR-224-5p表达升高，EGR2 mRNA及蛋白表达下降；与Lv-sh-NC组相比，Lv-sh-miR-224-5p组HepG2细胞24 h EdU阳性细胞率、细胞侵袭数及48 h细胞迁移率降低，细胞凋亡率增加；与Oe-NC组相比，Oe-EGR2组HepG2细胞24 h EdU阳性细胞率、细胞侵袭数及48 h细胞迁移率降低，细胞凋亡率增加；与Lv-sh-NC组相比，Lv-sh-miR-224-5p组EGR2蛋白水平表达升高；与Lv-sh-miR-224-5p+si-NC组相比，Lv-sh-miR-224-5p+si-EGR2组HepG2细胞24 h EdU阳性细胞率、细胞侵袭数及48 h细胞迁移率升高，细胞凋亡率下降。结论 miR-224-5p通过与EGR2结合从而促进HepG2细胞增殖、侵袭和迁移，抑制细胞凋亡。
不同剂量万古霉素诱导大鼠急性肾损伤模型的评价
马菲;邓琴香;施瑞;王春;徐丙发;目的 探究使用不同剂量万古霉素(VCM)建造SD大鼠急性肾损伤(AKI)模型的方法及其评价。方法 6周龄雄性SD大鼠随机分为4组，正常对照(NC)组、VCM(200、400、600)mg/kg组；腹腔注射给药1次/d,连续7 d;检测大鼠血清尿素氮(BUN)、肌酐(Cre)水平；取肾脏称重，计算肾体比；肾组织进行HE及PAS染色，光镜下观察肾脏病理损伤程度。结果 随着VCM剂量的增加，各剂量组大鼠血清BUN和Cre水平呈升高趋势(F=3.85,P<0.05;F=9.02,P<0.01),且VCM 600 mg/kg组与VCM(200、400)mg/kg组相比Cre水平最高，差异具有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。随着VCM剂量的增加，各剂量组大鼠体质量呈下降趋势(F=54.81,P<0.01),肾总重和肾体比呈上升趋势(F=11.13,F=14.43,均P<0.01),且VCM 600 mg/kg组与VCM(200、400)mg/kg组相比，大鼠体质量、肾总重、肾体比差异均有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。HE染色和PAS染色显示，各剂量组肾小管出现不同程度的损伤，随着VCM剂量的增加，肾损伤评分升高(F=105.80,F=28.89,均P<0.01),且VCM 600 mg/kg组肾小管上皮细胞脱落、肿胀、管型形成等病理损伤最严重。结论 VCM 600 mg/kg以1次/d、连续7 d腹腔注射可稳定建立大鼠AKI模型。
高转移性结直肠癌细胞通过分泌KLF4诱导M2型巨噬细胞极化对结直肠癌免疫逃逸的影响
尚靖;路畅;侯阳波;袁沁;李炜;王海静;陈进宝;目的 探讨高转移性结直肠癌细胞HCT116诱导M2型巨噬细胞极化对结直肠癌免疫逃逸的影响及其机制。方法 将结直肠癌细胞条件培养基(CM)与佛波酯(PMA)诱导的M0型巨噬细胞共培养后，通过流式细胞术、实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)观察M2型巨噬细胞极化状态；将CMM0、CMSW480-Mφ和CMHCT116-Mφ与HCT116细胞共培养后，通过Western blot和qPCR检测程序性死亡受体配体1(PD-L1)的表达情况，同时将刺激后的HCT116细胞与人源T淋巴细胞共培养，检测HCT116细胞存活情况及上清液中的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和干扰素-γ(IFN-γ)水平；用Western blot、qPCR和ELISA检测SW480和HCT116细胞中Kruüppel样因子4(KLF4)表达差异；用KFL4抑制剂肯帕罗酮(Ken)预处理HCT116细胞后，将CMHCT116-Mφ和CM_((HCT116+Ken)-Mφ)与M0型巨噬细胞共培养，通过流式细胞术、qPCR、ELISA实验观察M2型巨噬细胞极化状态。将CMHCT116-Mφ和CM_((HCT116+Ken)-Mφ)与HCT116细胞共培养后，通过Western blot和qPCR检测PD-L1的表达情况。结果 M0型巨噬细胞在CM刺激后，HCT116-Mφ细胞中CD11b+CD206+细胞比例更高，M2型巨噬细胞标志物白细胞介素(IL)-10及转化生长因子-β(TGF-β)表达更高；相比于CMSW480-Mφ组，CMHCT116-Mφ组的PD-L1蛋白表达水平更高；与T淋巴细胞共培养后，CMHCT116-Mφ组细胞存活最多，同时TNF-α和IFN-γ水平最低；加入Ken后，M2型巨噬细胞极化比例及标志物均降低。与CMHCT116-Mφ组相比，CM_((HCT116+Ken)-Mφ)组HCT116细胞PD-L1表达下降。结论 高转移性结直肠癌细胞通过分泌KLF4诱导M2型巨噬细胞极化促进结直肠癌细胞PD-L1表达，促进肿瘤免疫逃逸。该研究有望为提高临床免疫治疗效果提供潜在靶点。
环状RNA hsa＿circ＿0002938在胃癌的表达及功能
李晓鹏;刘思涵;赵一杰;李书梅;殷小磊;目的 探索环状RNA(circRNA)hsa＿circ＿0002938在胃癌中的表达及其生物学功能。方法 收集入院手术切除的45例胃癌患者的癌组织和相应癌旁组织，同时常规培养人胃癌细胞SGC-7901、BGC-823、HGC-27和MGC-803以及永生化胃黏膜上皮细胞GES-1。采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测hsa＿circ＿0002938在胃癌组织和细胞中的表达水平，利用卡方检验分析其与患者临床病理特征之间的关系，Kaplan-Meier生存分析评估其表达水平与患者预后的相关性。细胞计数试剂盒8(CCK-8)、划痕愈合实验、Transwell实验检测hsa＿circ＿0002938对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。进一步利用生物信息学分析预测hsa＿circ＿0002938可能结合的微小RNA(miRNA)及其下游的靶基因，构建竞争性内源RNA(ceRNA)调控网络，并对靶基因进行功能富集。结果 hsa＿circ＿0002938在胃癌组织和胃癌细胞中的表达水平高于癌旁组织和GES-1细胞(P<0.05),hsa＿circ＿0002938高表达组患者术后2年无进展生存期缩短(P<0.01)。敲低hsa＿circ＿0002938后，胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力均下降(P<0.05)。生物信息学预测分析显示hsa＿circ＿0002938可结合hsa-miR-342-3p和hsa-miR-503-5p,功能富集结果显示miRNA下游靶基因富集于丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、Hippo及Wnt等多个癌症相关信号通路。结论 在胃癌组织和细胞中呈高表达的hsa＿circ＿0002938与患者的不良预后密切相关，敲低hsa＿circ＿0002938可抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。研究揭示了hsa＿circ＿0002938在胃癌进展中的潜在作用，为胃癌的防治提供了新思路。