文献
耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌荚膜特异性解聚酶克隆表达及其相关功能研究
闫涛;汪娜;王秋妍;马成成;滕宣;余可雪;葛宏华;刘周;目的 构建K64型荚膜特异性解聚酶重组蛋白Dep44,探讨其在对抗耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)感染中的应用效力。方法 分离表达解聚酶的噬菌体(vB＿Kpn＿HF1013,GenBank:PP803128),分析其基因序列，筛选具有解聚酶活性的候选蛋白，构建重组蛋白Dep44并验证其解聚酶活性。通过滴板法验证Dep44重组蛋白的敏感谱，通过生物膜清除及血清杀菌实验评估Dep44抗菌活性。结果 噬菌体vB＿Kpn＿HF1013尾刺蛋白具有解聚酶活性，能特异性裂解K64型CRKP荚膜。生物膜清除实验结果显示：与对照组比较，2μg/mL与10μg/mL剂量的Dep44重组蛋白均可有效破坏细菌生物膜。血清杀菌实验结果显示：Dep44重组蛋白具有协同血清杀菌能力，但这种作用需要依赖补体系统的存在，Dep44本身不具备直接杀菌活性。结论 Dep44重组蛋白能够特异性裂解K64型CRKP荚膜，具备破坏生物膜及协同血清杀菌能力，有望应用于K64型CRKP相关感染的控制及医疗器械表面生物膜的清除。
犬尿氨酸-3-单加氧酶在类风湿关节炎患者外周血单个核细胞和滑膜组织中的表达及意义
宗雪梅;林茜茜;陈悦兰;王鑫铭;魏伟;严尚学;常艳;目的 探讨犬尿氨酸-3-单加氧酶(KMO)在类风湿关节炎(RA)患者外周血单个核细胞(PBMC)、滑膜组织和成纤维样滑膜细胞(FLS)中的表达及临床意义。方法 收集25例健康对照(HC)个体和25例确诊为RA患者的外周血样本，采用实时荧光定量PCR和Western blot法对RA组和HC组PBMC中KMO基因和蛋白表达进行检测，并分析RA患者PBMC中KMO基因表达水平与实验室检测指标之间的相关性。同时，利用免疫组化和免疫荧光技术检测RA组和HC组滑膜组织及FLS中KMO的表达情况。结果 (1) RA组PBMC中KMO基因和蛋白表达高于HC组，差异有统计学意义(P<0.001)。(2) RA组PBMC中KMO基因表达水平与疾病活动指数28评分、血沉、类风湿因子呈正相关(r_s=0.417,P=0.038;r=0.545,P=0.005;r_s=0.433,P=0.031),与C反应蛋白、抗环瓜氨酸多肽抗体无相关性。(3) RA组滑膜组织中KMO表达高于HC组，差异有统计学意义(P<0.01);RA组滑膜组织FLS中KMO表达高于HC组，差异有统计学意义(P<0.001)。结论 RA患者PBMC、滑膜组织及FLS中KMO表达增加，且KMO基因表达水平与RA患者疾病活动性相关，提示KMO可能促进RA病程。
肿瘤坏死因子受体相关因子2杂合子敲除小鼠构建和表型研究
王伟康;左书俊;谷金涛;郭富媛;郭昊周;韩陈陈;魏伟;目的 应用CRISPR/Cas9技术构建肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)杂合子敲除小鼠，用于研究TNF-α-TRAF2信号转导异常介导的炎症免疫性疾病的病理机制及新靶点药物的开发。方法 构建靶向敲除TRAF2基因的载体，通过显微注射，将先导RNA和Cas9 mRNA导入到C57BL/6JGpt小鼠的受精卵中，介导小鼠TRAF2基因突变，提取鼠尾蛋白，通过PCR和Western blot测定F0代基因型，成功获得TRAF2~(+/-)小鼠。使用F0代小鼠与C57BL/6JGpt野生型小鼠回交，获得稳定的TRAF2~(+/-)小鼠用于扩繁及后续实验。检测TRAF2~(+/-)小鼠体质量；Western blot检测TRAF2~(+/-)小鼠脾脏、肝脏及肾脏组织中TRAF2表达；HE染色检测TRAF2~(+/-)小鼠脾脏、肝脏及肾脏组织的发育情况。结果 利用引物进行PCR鉴定，结果表明TRAF2~(+/-)小鼠在679 bp出现目的条带；Western blot结果表明，与野生型组比较，TRAF2~(+/-)小鼠鼠尾蛋白中TRAF2的表达明显下降(P<0.01)。与野生型小鼠比较，TRAF2~(+/-)小鼠体质量减轻(P<0.05);Western blot结果表明，与野生型小鼠比较，TRAF2~(+/-)小鼠的脾脏、肝脏及肾脏组织中TRAF2蛋白表达均降低(P<0.01)。HE染色结果表明，与野生型小鼠比较，TRAF2~(+/-)小鼠脾脏、肝脏及肾脏组织内细胞形态无明显差异。结论 成功构建TRAF2~(+/-)小鼠，为探究TRAF2在发育调控中的作用、揭示TNF-α-TRAF2信号异常介导的炎症免疫疾病机制以及筛选相关药物靶点提供了重要动物模型。
黄芪提取物对类风湿关节炎继发肺间质病变大鼠肺损伤的影响及机制
赵悦;杨金良;罗寰;席文秀;王珺璐;郑学军;目的 研究黄芪提取物(AME)对类风湿关节炎继发肺间质病变(RA-ILD)大鼠肺损伤及骨髓分化因子88(MyD88)/toll样受体4(TLR4)/核因子κB(NF-κB) p65通路的影响。方法 将SD大鼠随机分为对照组、RA-ILD组、AME低剂量组(5 g/L)、AME高剂量组(10 g/L)、AME高剂量+脂多糖(LPS)组(10 g/L AME+1 mg/L TLR4激活剂LPS)。除对照组外，其余组大鼠均通过注射牛Ⅱ型胶原蛋白、弗氏完全佐剂和博莱霉素构建RA-ILD模型；检测大鼠关节炎指数、肺组织湿干重比；ELISA检测肺泡灌洗液炎症因子白细胞介素(IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平；苏木精-伊红染色观察大鼠膝关节组织和肺组织病理学变化；Western blot检测大鼠肺组织自噬因子苄氯素1(Beclin 1)、微管相关蛋白1A/1B-轻链3(LC3)Ⅱ/Ⅰ及MyD88/TLR4/NF-κB p65通路相关蛋白表达。结果 与对照组比较，RA-ILD组大鼠膝关节组织和肺组织受损，关节炎指数、肺组织湿干重比、IL-1β、IL-6和TNF-α水平、MyD88、TLR4蛋白表达水平及p-NF-κB p65/NF-κB p65比值升高(P<0.01),Beclin 1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达降低(P<0.01);与RA-ILD组比较，AME低剂量组、AME高剂量组大鼠组织损伤减轻，关节炎指数、肺组织湿干重比、IL-1β、IL-6和TNF-α水平、MyD88、TLR4蛋白表达水平及p-NF-κB p65/NF-κB p65比值呈剂量依赖性降低(P<0.05或P<0.01),Beclin 1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达呈剂量依赖性升高(P<0.05或P<0.01);与AME高剂量组比较，AME高剂量+LPS组大鼠组织损伤加重，关节炎指数、肺组织湿干重比、IL-1β、IL-6和TNF-α水平、MyD88、TLR4蛋白表达水平及p-NF-κB p65/NF-κB p65比值升高(P<0.01),Beclin 1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达降低(P<0.01)。结论 AME抑制MyD88/TLR4/NF-κB p65通路，缓解RA-ILD大鼠肺损伤。
基于网络药理学和体内实验验证肉苁蓉抗阿尔茨海默病作用及机制
赵杰;霍东升;祝洪博;张士滨;贾建新;目的 通过网络药理学、分子对接和动物实验验证的方法，探讨中药肉苁蓉治疗阿尔茨海默病(AD)的作用机制。方法 依据中药系统药理数据库与分析平台挖掘肉苁蓉有效成分，并通过SwissTargetPrediction、DisGeNET和GeneCards数据库筛选出肉苁蓉和AD相关靶标，并对两者交集靶点进行蛋白相互作用网络(PPI)分析。通过Metascape数据库进行京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析；利用AutoDock Vina对肉苁蓉有效成分与核心靶点进行分子对接；在网络药理学预测基础上，采用8月龄SAMP8系小鼠建立AD模型，通过Morris水迷宫测试小鼠学习认知功能，尼氏染色观测小鼠海马神经元形态，ELISA、Western blot实验检测小鼠海马组织中cAMP信号通路相关蛋白表达水平。结果 基于网络药理学分析预测，肉苁蓉可能通过8种活性成分作用于74个AD靶点。分子对接结果显示毛蕊花糖苷等活性成分与ESR1、BDNF、MAPK1、APP等核心靶点具有较高亲和力。KEGG结果分析主要涉及癌症的通路、cAMP信号通路、AD通路等。动物实验结果表明，肉苁蓉能有效改善AD小鼠的学习认知功能障碍，改善小鼠海马神经元损伤。ELISA、Western blot实验结果表明，肉苁蓉能显著提高cAMP通路cAMP、PKA、P-CREB蛋白表达水平，并促进下游神经营养因子BDNF蛋白的表达。结论 肉苁蓉可以改善AD模型小鼠学习认知障碍，并且可能通过上调cAMP信号通路及下游BDNF蛋白靶点的表达，改善海马神经元损伤而发挥治疗AD的作用。
CCR2基因敲除小鼠的构建及基因型鉴定
张慧茹;王安琪;刘崇;周园园;薛慧;涂佳杰;目的 探讨C-C趋化因子受体2型(CCR2)基因敲除鼠的繁育和基因型分析，验证聚合酶链式反应(PCR)法对CCR2基因敲除鼠基因型检测的适用性。方法 将引进的CCR2纯合雄性小鼠和野生型雌性小鼠进行交配繁殖出子一代，获得的F1代杂合子小鼠继续进行交配，待小鼠2周龄时剪尾部组织提取DNA,PCR法扩增目的基因片段，琼脂糖凝胶电泳进行基因型结果判定。通过遗传杂交，提高产生携带CCR2基因敲除纯合子后代比例，采用Western blot技术针对主要免疫细胞及关键脏器验证后代小鼠中CCR2基因的敲除效果，使用流式细胞术针对主要免疫细胞检测CCR2基因的敲除对免疫系统功能是否有影响。结果 成功繁育并鉴定了CCR2基因敲除鼠，得到了3种基因型的F2代小鼠：CCR2~(+/+)、CCR2~(+/-)、CCR2~(-/-)。通过PCR法鉴别了子代基因型，Western blot显示CCR2基因敲除小鼠中CCR2蛋白表达极低。流式分析表明，CCR2基因敲除会减少小鼠脾脏来源T细胞中CD4~+T和Th1型细胞表达，但不影响巨噬细胞功能。结论 正确的繁殖和鉴定是得到纯合CCR2基因敲除鼠的重要途径，PCR法鉴别小鼠基因型具有简便、快捷、可靠的特点。
LncRNA MALAT1/miR-15b-5p调控Wnt/β-catenin通路对脂多糖诱导软骨细胞损伤的影响
赵志;刘梦鲲;查日飞;张汀葆;王珵;目的 探讨骨关节炎中长链非编码RNA转移相关肺腺癌转录物1(MALAT1)/微小RNA-15b-5p(miR-15b-5p)调控Wnt/β-catenin通路在脂多糖(LPS)诱导软骨损伤中的分子机制。方法 以5 mg/L LPS处理ATDC5细胞形成骨关节炎细胞损伤模型，RT-qPCR检测细胞中MALAT1和miR-15b-5p的表达。MTT、流式细胞术、茜素红染色和ELISA检测MALAT1和miR-15b-5p对LPS诱导的软骨细胞损伤的影响。双荧光素酶报告基因实验检验MALAT1和miR-15b-5p的调控关系。Western blot检测相关蛋白的表达情况。结果 在LPS诱导的ATDC5细胞中，MALAT1表达降低(P<0.05)。与Control组比较，LPS组细胞活性降低，凋亡率升高，肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6、白细胞介素-1β水平升高，钙化结节增多，MMP13、ADAMTS5蛋白表达水平升高，CollagenⅡ、Aggrecan蛋白表达水平降低，Wnt1和β-catenin蛋白表达水平升高(P<0.05)。MALAT1过表达可消减LPS对软骨细胞活性、凋亡、炎症反应、成骨分化、细胞外基质降解和Wnt/β-catenin通路的影响(P<0.05);而miR-15b-5p过表达增强了LPS对软骨细胞的作用(P<0.05)。结论 MALAT1在LPS诱导的软骨细胞中低表达，其通过靶向miR-15b-5p抑制Wnt/β-catenin通路减轻LPS诱导的软骨细胞损伤。
P2X7R在心肌重构中的作用
杨莎莎;莫莉花;王辉波;心血管疾病是全球最主要的死亡原因之一，其中心肌重构是大多数心血管疾病发生发展的核心。嘌呤能配体门控离子通道7受体(P2X7R)是嘌呤能受体家族成员之一，它在免疫细胞、心肌平滑肌细胞和内皮细胞中表达，在免疫系统调节、神经保护和炎症反应等相关的病理过程中起着重要作用。P2X7R的激活在心肌重构中发挥重要作用，包括心肌纤维化、心肌肥大及心力衰竭。因此，该文对P2X7R的结构、功能特性以及其在心肌重构中的作用机制进行综述。
ET-1在中枢神经系统特发性炎性脱髓鞘疾病中的表达及其临床意义
宋晨蕊;刘艳群;毕晓莹;目的 探究中枢神经系统特发性炎性脱髓鞘疾病(IIDDs)进程中，内皮素-1(ET-1)的表达水平与疾病残疾程度的相关性。方法 纳入45例中枢神经系统脱髓鞘疾病患者，其中IIDDs患者25例，中枢神经系统血管性脱髓鞘疾病患者20例，同时纳入健康对照者10例。用ELISA的方法测定患者血清ET-1水平，并进一步分析IIDDs组患者血清ET-1水平与实验室检验指标、情绪认知功能及疾病残疾程度的相关性。结果 (1)在三组中，IIDDs组血清ET-1含量最高(P<0.000 1),血清ET-1在血管性脱髓鞘疾病组表达水平较健康对照组降低，但差异无统计学意义。(2) IIDDs中EDSS评分重度障碍患者血清ET-1水平较EDSS评分轻中度障碍患者升高(Z=-3.250,P=0.001);EDSS评分与血清ET-1水平(r_s=0.503,P=0.010)、脑脊液总蛋白(r_s=0.475,P=0.016)、脑脊液白蛋白(r_s=0.480,P=0.020)、脑脊液IgG(r_s=0.544,P=0.007)、脑脊液IgA(r_s=0.660,P=0.002)及脑脊液IgM(r_s=0.555,P=0.011)水平存在正相关性。(3) IIDDs组患者血清ET-1水平与脑脊液IgM水平(r_s=0.455,P=0.044)存在正相关性，与外周免疫指标无明显相关性(P>0.05)。结论 血清ET-1水平反映了IIDDs临床症状的严重程度，且与外周免疫指标无明显相关性，但与疾病严重程度及脑脊液IgM水平存在正相关性，提示血清ET-1水平可反映中枢神经系统炎症程度，并在IIDDs发生发展中起到重要作用。