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基于RNA-seq筛选高耐药且高毒力金黄色葡萄球菌肺部感染过程中的自噬相关基因
查锦宏;匡琪;吴承僖;朱小雨;苏铎;张丽丽;吕蒙;胡凌飞;周冬生;杨文慧;目的 筛选高耐药且高毒力耐甲氧西林金黄色葡萄球菌USA300（USA300）肺部感染过程中的自噬相关基因，探讨其分子机制，为免疫治疗靶点提供思路。方法 从GEO数据库获取USA300肺部感染小鼠模型数据集GSE220943，采用DESeq2筛选差异表达基因（DEGs），结合MSigDB和Autophagy数据库获取自噬相关基因（ARGs），通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）构建共表达模块，取与DEGs和ARGs的交集获得自噬相关基因。利用clusterProfiler R包进行基因本体（GO）富集分析，Metascape网站进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，ImmuCellAI-mouse网站分析免疫浸润，String数据库构建蛋白-蛋白互作用（PPI）网络，Cytoscape软件拓扑分析筛选关键基因，并通过网站（https://www.bioinformatics.com.cn）绘制ROC曲线。最终通过实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应（RT-qPCR）在小鼠肺组织中验证关键基因表达。结果 在感染后12、24、48、96 h分别筛选出6 135、4 075、3 680和2 342个DEGs，结合WGCNA和ARGs共筛选出19个自噬相关基因。GO和KEGG分析显示，这些基因参与CD4? T细胞激活调控、先天免疫反应、自噬小体膜等过程。免疫浸润分析发现，感染初期以中性粒细胞、树突细胞等先天免疫细胞为主，后期转向γδT细胞、M2型巨噬细胞等细胞类型。PPI网络筛出12个核心自噬基因，进一步确定3个上调关键基因（Eif2ak2、Ikbke、Nfkbiz），其ROC曲线AUC均为1。RT-qPCR验证显示，3个基因在感染24 h肺组织中表达升高（均P<0.05）。结论 Eif2ak2、Ikbke和Nfkbiz可能通过促进自噬参与USA300肺部感染过程，有望成为潜在免疫治疗靶点。
铁死亡在椎间盘退变中的研究进展
刘建军;余水生;荆珏华;田大胜;铁死亡是一种铁依赖性的、以脂质过氧化为主要特征的新型细胞死亡方式，自2012年首次提出以来，逐渐引起关注并得到快速发展。铁死亡在恶性肿瘤、心血管疾病以及神经系统疾病中均具有重要的作用，目前已成为生命科学和医学领域研究的热点。铁死亡与铁过载密切相关，铁过载与脂质过氧化物的蓄积共同参与椎间盘稳态的破坏，导致椎间盘退变的发生，但目前关于铁死亡在椎间盘退变中的作用机制尚未明确。本文就铁死亡与椎间盘退变的关系、分子调节机制及其在临床应用潜力方面进行综述，旨在为椎间盘退变提供新的治疗靶点。
黄曲霉产生的细胞外囊泡对黄曲霉感染的治疗评价
周建鸿;汪莉;姚朗宣;张春林;江银辉;目的 探讨黄曲霉细胞外囊泡（EVs）对黄曲霉感染的治疗效果。方法 使用超速离心法提取黄曲霉的EVs，通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）检测和鉴定EVs；qRT-PCR和酶联免疫吸附试剂盒检测黄曲霉EVs对骨髓源巨噬细胞（BMDMs）极化的影响和几种细胞因子的表达水平，包括肿瘤坏死因子α（TNF-α）、干扰素-γ（IFN-γ）、白介素-6（IL-6）和白介素-10（IL-10）；构建大蜡螟感染模型，设置黄曲霉EVs的3个浓度组（0.2、2、20μg/条幼虫）作为实验组，PBS作为感染模型对照组，同时设置3种形式的阴性对照组，包括PBS组、穿刺组，空白对照组，通过大蜡螟感染模型的存活率评价黄曲霉EVs对黄曲霉感染的治疗效果。结果 黄曲霉EVs粒径在20～550nm之间；黄曲霉EVs能够使BMDMs向M1表型和M2表型极化，并产生细胞因子，包括TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-10；大蜡螟感染模型结果显示黄曲霉EVs可提高黄曲霉感染后大蜡螟的存活率。结论 黄曲霉产生的EVs可促进BMDMs的促炎细胞因子和抗炎细胞因子表达，促进BMDMs向M1表型和M2表型极化，同时增加大蜡螟感染黄曲霉后的存活率。
皮质酮预处理对LPS激活小胶质细胞的调节作用及鸡豆黄素A的抑制作用
牛耕辰;王俊;张悦;尹艳艳;目的 探讨皮质酮（CORT）预处理对脂多糖（LPS）激活小胶质细胞的调节作用及鸡豆黄素A（Bio A）对小胶质细胞活化的抑制作用。方法 用MTT法筛选出LPS、CORT和Bio A对BV2细胞的最适浓度；将BV2细胞分为5组： Control组、CORT（50 nmol/L）组、LPS（1 μg/mL）组、LPS（1 μg/mL）+ CORT（50 nmol/L）组、LPS（1 μg/mL）+ CORT（50 nmol/L）+Bio A（5 μmol/L）组，除对照组外，各组先加入CORT（50 nmol/L）孵育2 h，然后各组加入相应浓度的LPS（1 μg/mL）和BioA（5 μmol/L）共同孵育36 h；DCFH-DA探针法测定活性氧（ROS）含量；Western blot法测定炎性细胞因子、5-羟色胺转运体（5-HTT）、糖皮质激素受体（GR）、盐皮质激素受体（MR）、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3 （NLRP3）、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白1（Caspase-1）的蛋白表达水平。结果 与CORT（50 nmol/L）组和LPS（1 μg/mL）组比较，CORT（50 nmol/L）+ LPS（1 μg/mL）组的BV2细胞的活力增加，ROS的含量更高，炎性细胞因子、NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白表达水平增加（P<0.05）；与CORT（50 nmol/L）+ LPS（1 μg/mL）组比较，CORT（50 nmol/L）+ LPS（1 μg/mL）+ Bio A（5 μmol/L）组的细胞活力降低，ROS的含量下降，炎性细胞因子、NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白表达减少（P<0.05）。结论 小剂量的CORT预处理可以促进LPS激活BV2细胞；Bio A抑制经CORT预处理后LPS诱导的BV2细胞活化，其机制可能与抑制NLRP3炎症小体的激活有关。
Kobophenol A通过Prdx6抑制LPS诱导的巨噬细胞M1型极化
陈天宇;王浩;王金虹;赵英杰;周仁鹏;胡伟;鲁超;目的 探究Kobophenol A（KPA）对脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞M1型极化的作用及机制，以期为炎症免疫性疾病的治疗和新药研发提供理论依据。方法 使用LPS诱导建立RAW264.7巨噬细胞M1型极化模型，并使用Prdx6的抑制剂MJ33和Prdx6-siRNA构建Prdx6沉默模型。采用不同浓度的KPA处理小鼠巨噬细胞系RAW264.7，CCK-8法检测细胞活力。Western blot和免疫荧光染色法检测巨噬细胞过氧化物还原酶6（Prdx6）和巨噬细胞M1型极化相关蛋白诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、环氧化酶-2（COX-2）的表达水平。RT-qPCR检测巨噬细胞Prdx6和巨噬细胞M1型极化相关基因iNOS、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）的表达水平。流式检测M1型巨噬细胞标志CD86分子(CD86)的表达情况。结果 与LPS诱导的巨噬细胞M1型极化模型相比，KPA可以显著恢复RAW264.7巨噬细胞M1型极化形态学变化，降低巨噬细胞M1型极化相关蛋白iNOS、COX-2、CD86和相关基因iNOS、IL-6、TNF-α的表达（均P<0.05）。此外，LPS显著下调RAW264.7巨噬细胞中Prdx6的表达，而加入KPA可以上调Prdx6的表达，并且Prdx6的抑制剂MJ33处理能够显著上调RAW264.7巨噬细胞M1型极化标志蛋白iNOS的表达，而KPA处理可以显著下调iNOS的表达（均P<0.05）。结论 KPA通过上调Prdx6的表达抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞M1型极化。
耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌荚膜特异性解聚酶克隆表达及其相关功能研究
闫涛;汪娜;王秋妍;马成成;滕宣;余可雪;葛宏华;刘周;目的 构建K64型荚膜特异性解聚酶重组蛋白Dep44,探讨其在对抗耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)感染中的应用效力。方法 分离表达解聚酶的噬菌体(vBKpnHF1013,GenBank:PP803128),分析其基因序列,筛选具有解聚酶活性的候选蛋白,构建重组蛋白Dep44并验证其解聚酶活性。通过滴板法验证Dep44重组蛋白的敏感谱,通过生物膜清除及血清杀菌实验评估Dep44抗菌活性。结果 噬菌体vBKpnHF1013尾刺蛋白具有解聚酶活性,能特异性裂解K64型CRKP荚膜。生物膜清除实验结果显示:与对照组比较,2μg/mL与10μg/mL剂量的Dep44重组蛋白均可有效破坏细菌生物膜。血清杀菌实验结果显示:Dep44重组蛋白具有协同血清杀菌能力,但这种作用需要依赖补体系统的存在,Dep44本身不具备直接杀菌活性。结论 Dep44重组蛋白能够特异性裂解K64型CRKP荚膜,具备破坏生物膜及协同血清杀菌能力,有望应用于K64型CRKP相关感染的控制及医疗器械表面生物膜的清除。
肿瘤坏死因子受体相关因子2杂合子敲除小鼠构建和表型研究
王伟康;左书俊;谷金涛;郭富媛;郭昊周;韩陈陈;魏伟;目的 应用CRISPR/Cas9技术构建肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)杂合子敲除小鼠,用于研究TNF-α-TRAF2信号转导异常介导的炎症免疫性疾病的病理机制及新靶点药物的开发。方法 构建靶向敲除TRAF2基因的载体,通过显微注射,将先导RNA和Cas9 mRNA导入到C57BL/6JGpt小鼠的受精卵中,介导小鼠TRAF2基因突变,提取鼠尾蛋白,通过PCR和Western blot测定F0代基因型,成功获得TRAF2+/-小鼠。使用F0代小鼠与C57BL/6JGpt野生型小鼠回交,获得稳定的TRAF2+/-小鼠用于扩繁及后续实验。检测TRAF2+/-小鼠体质量;Western blot检测TRAF2+/-小鼠脾脏、肝脏及肾脏组织中TRAF2表达;HE染色检测TRAF2+/-小鼠脾脏、肝脏及肾脏组织的发育情况。结果 利用引物进行PCR鉴定,结果表明TRAF2+/-小鼠在679 bp出现目的条带;Western blot结果表明,与野生型组比较,TRAF2+/-小鼠鼠尾蛋白中TRAF2的表达明显下降(P <0.01)。与野生型小鼠比较,TRAF2+/-小鼠体质量减轻(P <0.05);Western blot结果表明,与野生型小鼠比较,TRAF2+/-小鼠的脾脏、肝脏及肾脏组织中TR AF2蛋白表达均降低(P<0.01)。HE染色结果表明,与野生型小鼠比较,TRAF2+/-小鼠脾脏、肝脏及肾脏组织内细胞形态无明显差异。结论 成功构建TRAF2+/-小鼠,为探究TRAF2在发育调控中的作用、揭示TNF-α-TRAF2信号异常介导的炎症免疫疾病机制以及筛选相关药物靶点提供了重要动物模型。
犬尿氨酸-3-单加氧酶在类风湿关节炎患者外周血单个核细胞和滑膜组织中的表达及意义
宗雪梅;林茜茜;陈悦兰;王鑫铭;魏伟;严尚学;常艳;目的 探讨犬尿氨酸-3-单加氧酶(KMO)在类风湿关节炎(RA)患者外周血单个核细胞(PBMC)、滑膜组织和成纤维样滑膜细胞(FLS)中的表达及临床意义。方法 收集25例健康对照(HC)个体和25例确诊为RA患者的外周血样本,采用实时荧光定量PCR和Western blot法对RA组和HC组PBMC中KMO基因和蛋白表达进行检测,并分析RA患者PBMC中KMO基因表达水平与实验室检测指标之间的相关性。同时,利用免疫组化和免疫荧光技术检测RA组和HC组滑膜组织及FLS中KMO的表达情况。结果(1)RA组PBMC中KMO基因和蛋白表达高于HC组,差异有统计学意义(P<0.001)。(2)RA组PBMC中KMO基因表达水平与疾病活动指数28评分、血沉、类风湿因子呈正相关(rs=0.417,P=0.038;rs=0.545,P=0.005;rs=0.433,P=0.031),与C反应蛋白、抗环瓜氨酸多肽抗体无相关性。(3)RA组滑膜组织中KMO表达高于HC组,差异有统计学意义(P<0.01);RA组滑膜组织FLS中KMO表达高于HC组,差异有统计学意义(P<0.001)。结论 RA患者PBMC、滑膜组织及FLS中KMO表达增加,且KMO基因表达水平与RA患者疾病活动性相关,提示KMO可能促进RA病程。
黄芪提取物对类风湿关节炎继发肺间质病变大鼠肺损伤的影响及机制
赵悦;杨金良;罗寰;席文秀;王珺璐;郑学军;目的 研究黄芪提取物(AME)对类风湿关节炎继发肺间质病变(RA-ILD)大鼠肺损伤及骨髓分化因子88(MyD88)/toll样受体4(TLR4)/核因子κB(NF-κB) p65通路的影响。方法 将SD大鼠随机分为对照组、RA-ILD组、AME低剂量组(5g/L)、AME高剂量组(10 g/L)、AME高剂量+脂多糖(LPS)组(10 g/L AME+1 mg/L TLR4激活剂LPS)。除对照组外,其余组大鼠均通过注射牛Ⅱ型胶原蛋白、弗氏完全佐剂和博莱霉素构建RA-ILD模型;检测大鼠关节炎指数、肺组织湿干重比;ELISA检测肺泡灌洗液炎症因子白细胞介素(IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;苏木精-伊红染色观察大鼠膝关节组织和肺组织病理学变化;Western blot检测大鼠肺组织自噬因子苄氯素1 (Beclin 1)、微管相关蛋白1A/1B-轻链3 (LC3)Ⅱ/Ⅰ及MyD88/TLR4/NF-κB p65通路相关蛋白表达。结果 与对照组比较,RA-ILD组大鼠膝关节组织和肺组织受损,关节炎指数、肺组织湿干重比、IL-1β、IL-6和TNF-α水平、MyD88、TLR4蛋白表达水平及p-NF-κB p65/NF-κB p65比值升高(P<0.01),Beclin 1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达降低(P<0.01);与RA-ILD组比较,AME低剂量组、AME高剂量组大鼠组织损伤减轻,关节炎指数、肺组织湿干重比、IL-1β、IL-6和TNF-α水平、MyD88、TLR4蛋白表达水平及p-NF-κB p65/NF-κB p65比值呈剂量依赖性降低(P<0.05或P<0.01),Beclin 1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达呈剂量依赖性升高(P<0.05或P<0.01);与AME高剂量组比较,AME高剂量+LPS组大鼠组织损伤加重,关节炎指数、肺组织湿干重比、IL-1β、IL-6和TNF-α水平、MyD88、TLR4蛋白表达水平及p-NF-κB p65/NF-κB p65比值升高(P<0.01),Beclin 1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达降低(P<0.01)。结论 AME抑制MyD88/TLR4/NF-κB p65通路,缓解RA-ILD大鼠肺损伤。
基于网络药理学和体内实验验证肉苁蓉抗阿尔茨海默病作用及机制
赵杰;霍东升;祝洪博;张士滨;贾建新;目的 通过网络药理学、分子对接和动物实验验证的方法,探讨中药肉苁蓉治疗阿尔茨海默病(AD)的作用机制。方法依据中药系统药理数据库与分析平台挖掘肉苁蓉有效成分,并通过SwissTargetPrediction、DisGeNET和GeneCards数据库筛选出肉苁蓉和AD相关靶标,并对两者交集靶点进行蛋白相互作用网络(PPI)分析。通过Metascape数据库进行京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析;利用AutoDock Vina对肉苁蓉有效成分与核心靶点进行分子对接;在网络药理学预测基础上,采用8月龄SAMP8系小鼠建立AD模型,通过Morris水迷宫测试小鼠学习认知功能,尼氏染色观测小鼠海马神经元形态,ELISA、Western blot实验检测小鼠海马组织中cAMP信号通路相关蛋白表达水平。结果 基于网络药理学分析预测,肉苁蓉可能通过8种活性成分作用于74个AD靶点。分子对接结果显示毛蕊花糖苷等活性成分与ESR1、BDNF、MAPK1、APP等核心靶点具有较高亲和力。KEGG结果分析主要涉及癌症的通路、cAMP信号通路、AD通路等。动物实验结果表明,肉苁蓉能有效改善AD小鼠的学习认知功能障碍,改善小鼠海马神经元损伤。ELISA、Western blot实验结果表明,肉苁蓉能显著提高cAMP通路cAMP、PKA、P-CREB蛋白表达水平,并促进下游神经营养因子BDNF蛋白的表达。结论 肉苁蓉可以改善AD模型小鼠学习认知障碍,并且可能通过上调cAMP信号通路及下游BDNF蛋白靶点的表达,改善海马神经元损伤而发挥治疗AD的作用。