CCR2基因敲除小鼠的构建及基因型鉴定
张慧茹;王安琪;刘崇;周园园;薛慧;涂佳杰;目的 探讨C-C趋化因子受体2型(CCR2)基因敲除鼠的繁育和基因型分析，验证聚合酶链式反应(PCR)法对CCR2基因敲除鼠基因型检测的适用性。方法 将引进的CCR2纯合雄性小鼠和野生型雌性小鼠进行交配繁殖出子一代，获得的F1代杂合子小鼠继续进行交配，待小鼠2周龄时剪尾部组织提取DNA,PCR法扩增目的基因片段，琼脂糖凝胶电泳进行基因型结果判定。通过遗传杂交，提高产生携带CCR2基因敲除纯合子后代比例，采用Western blot技术针对主要免疫细胞及关键脏器验证后代小鼠中CCR2基因的敲除效果，使用流式细胞术针对主要免疫细胞检测CCR2基因的敲除对免疫系统功能是否有影响。结果 成功繁育并鉴定了CCR2基因敲除鼠，得到了3种基因型的F2代小鼠：CCR2+/+、CCR2+/-、CCR2-/-。通过PCR法鉴别了子代基因型，Western blot显示CCR2基因敲除小鼠中CCR2蛋白表达极低。流式分析表明，CCR2基因敲除会减少小鼠脾脏来源T细胞中CD4~+T和Th1型细胞表达，但不影响巨噬细胞功能。结论 正确的繁殖和鉴定是得到纯合CCR2基因敲除鼠的重要途径，PCR法鉴别小鼠基因型具有简便、快捷、可靠的特点。
黄芪提取物对类风湿关节炎继发肺间质病变大鼠肺损伤的影响及机制
赵悦;杨金良;罗寰;席文秀;王珺璐;郑学军;目的 研究黄芪提取物(AME)对类风湿关节炎继发肺间质病变(RA-ILD)大鼠肺损伤及骨髓分化因子88(MyD88)/toll样受体4(TLR4)/核因子κB(NF-κB) p65通路的影响。方法 将SD大鼠随机分为对照组、RA-ILD组、AME低剂量组(5 g/L)、AME高剂量组(10 g/L)、AME高剂量+脂多糖(LPS)组(10 g/L AME+1 mg/L TLR4激活剂LPS)。除对照组外，其余组大鼠均通过注射牛Ⅱ型胶原蛋白、弗氏完全佐剂和博莱霉素构建RA-ILD模型；检测大鼠关节炎指数、肺组织湿干重比；ELISA检测肺泡灌洗液炎症因子白细胞介素(IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平；苏木精-伊红染色观察大鼠膝关节组织和肺组织病理学变化；Western blot检测大鼠肺组织自噬因子苄氯素1(Beclin 1)、微管相关蛋白1A/1B-轻链3(LC3)Ⅱ/Ⅰ及MyD88/TLR4/NF-κB p65通路相关蛋白表达。结果 与对照组比较，RA-ILD组大鼠膝关节组织和肺组织受损，关节炎指数、肺组织湿干重比、IL-1β、IL-6和TNF-α水平、MyD88、TLR4蛋白表达水平及p-NF-κB p65/NF-κB p65比值升高(P<0.01),Beclin 1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达降低(P<0.01);与RA-ILD组比较，AME低剂量组、AME高剂量组大鼠组织损伤减轻，关节炎指数、肺组织湿干重比、IL-1β、IL-6和TNF-α水平、MyD88、TLR4蛋白表达水平及p-NF-κB p65/NF-κB p65比值呈剂量依赖性降低(P<0.05或P<0.01),Beclin 1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达呈剂量依赖性升高(P<0.05或P<0.01);与AME高剂量组比较，AME高剂量+LPS组大鼠组织损伤加重，关节炎指数、肺组织湿干重比、IL-1β、IL-6和TNF-α水平、MyD88、TLR4蛋白表达水平及p-NF-κB p65/NF-κB p65比值升高(P<0.01),Beclin 1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达降低(P<0.01)。结论 AME抑制MyD88/TLR4/NF-κB p65通路，缓解RA-ILD大鼠肺损伤。
氨氯地平通过抑制足细胞的Ca2+内流促进细胞自噬
赵韦;徐德苹;廖开楠;蔡春林;臧丹丹;周海胜;目的 探究降血压药物氨氯地平对足细胞内Ca2+内流及其自噬的影响。方法 体外常规培养永生化的人足细胞(HPC),使用血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)以及L型Ca2+阻断剂氨氯地平单独或者联合处理HPC细胞，Ca2+成像系统实时检测药物处理后HPC细胞内Ca2+通量的瞬时变化；Western blot法检测自噬标志蛋白LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值变化、Beclin-1、P62和凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达水平；流式细胞术检测488 nm处Fluo-4AM的阳性细胞数以分析HPC细胞内Ca2+内流水平；Lyso-Tracker Green活细胞染色分析溶酶体荧光强度；流式细胞术检测HPC细胞凋亡率。结果 与对照组比较，AngⅡ组Ca2+瞬时通量和Fluo-4AM阳性细胞数显著增加(P<0.001)、自噬标志蛋白LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值(P<0.001)和Beclin-1的蛋白表达(P<0.01)均降低、P62的表达升高(P<0.01)、溶酶体荧光强度减弱(P<0.05)、细胞凋亡率升高(P<0.000 1)、凋亡相关蛋白Bcl-2表达降低(P<0.01)、Bax蛋白升高(P<0.001)。与对照组比较，氨氯地平组Fluo-4AM阳性细胞数显著降低(P<0.001)、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值(P<0.001)和Beclin-1的蛋白表达(P<0.001)均升高、P62蛋白表达降低(P<0.05)、溶酶体荧光强度增强(P<0.01)、细胞凋亡率降低(P<0.01)、Bcl-2蛋白表达升高(P<0.001)、Bax蛋白降低(P<0.001)。与AngⅡ组比较，AngⅡ+氨氯地平组Fluo-4AM阳性细胞数显著降低(P<0.001)、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值(P<0.01)以及Beclin-1的蛋白表达升高(P<0.05)、P62蛋白降低(P<0.01)、溶酶体荧光强度增加(P<0.05)、细胞凋亡率降低(P<0.001)、Bcl-2蛋白表达升高(P<0.001)、Bax蛋白表达降低(P<0.001)。结论 氨氯地平抑制足细胞内Ca2+内流，促进足细胞自噬、抑制凋亡，对于预防高血压肾病发生具有一定的作用。
澳洲茄碱调控STAT3信号通路对肺腺癌细胞生物学行为的影响
马贝贝;程联钰;张忠伟;叶广彬;李艳丽;凌博;目的 探讨澳洲茄碱调控STAT3信号通路对肺腺癌细胞生物学行为的影响。方法 分别用0.125、0.25、0.5、0.75 mmol/L澳洲茄碱作用于肺腺癌H1299细胞。CCK-8实验检测H1299细胞增殖活力；划痕、Transwell迁移和侵袭实验检测H1299细胞迁移、侵袭能力；流式细胞术和Hoechest 33258/PI双染法检测H1299细胞凋亡水平；Western blot实验检测H1299细胞STAT3、p-STAT3、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Cl-Caspase-3、Snail、Slug、N-cadherin和E-cadherin的蛋白表达水平。结果 不同浓度澳洲茄碱均可显著降低H1299细胞的增殖(P<0.05);0.125、0.25 mmol/L澳洲茄碱可促进H1299细胞的凋亡(P<0.05),抑制H1299细胞的迁移和侵袭(P<0.05)。澳洲茄碱能抑制STAT3、p-STAT3和Bcl-2蛋白表达，增强Bax、Caspase-3和Cl-Caspase-3蛋白表达。澳洲茄碱能通过抑制细胞STAT3的活化，降低Snail、Slug、N-cadherin蛋白表达，增强E-cadherin蛋白表达(P<0.05)。结论 澳洲茄碱能通过抑制STAT3活化，激活Bcl-2/Bax/Caspase3凋亡通路，抑制肺腺癌H1299细胞持续增殖，促进肺腺癌H1299细胞凋亡。同时能通过抑制STAT3活化，降低Snail/Slug蛋白表达，影响肺腺癌H1299细胞上皮间质转化，抑制肺腺癌H1299细胞的迁移和侵袭。
PGC-1α介导的线粒体生物合成在AMPK激动剂抗肝脏缺血再灌注损伤中的作用
敖宇;张旭阳;唐聃;刘公伟;黄丹;蔡治方;目的 探讨PGC-1α介导的线粒体生物合成在腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)激动剂抗肝脏缺血再灌注损伤(HIRI)中的作用及机制。方法 将SD大鼠随机分为对照组(Control)、HIRI组、HIRI+AMPK激动剂AICAR组(HIRI+AICAR)、HIRI+PGC-1α抑制剂SR-18292组(HIRI+SR-18292)和HIRI+AICAR+SR-18292组，每组8只。于术前分别经腹腔注射AICAR(500 mg/kg)或SR-18292(32 mg/kg)干预大鼠，采用无创血管夹阻断法构建HIRI模型，再灌注24 h后取材。检测血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)含量及肝脏组织中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和三磷酸腺苷(ATP)水平；HE染色观察肝组织病理学变化；荧光探针法检测肝组织中活性氧(ROS)水平和线粒体膜电位变化；qRT-PCR检测肝组织中线粒体DNA(mtDNA)拷贝数及线粒体生物合成相关基因PGC-1α、NRF1、TFAM、UQCRC2 mRNA表达水平；Western blot检测肝组织中AMPKα、p-AMPKα、mTOR、p-mTOR、PGC-1α和TFAM蛋白表达水平。结果 与Control组比较，HIRI组大鼠血清中ALT、AST水平及肝组织中MDA、ROS水平升高，SOD和ATP水平降低(均P<0.05);同时，肝组织中mtDNA拷贝数、线粒体膜电位及PGC-1α、NRF1、TFAM、UQCRC2 mRNA表达水平降低，p-AMPKα/AMPKα蛋白比值和PGC-1α、TFAM蛋白表达水平降低，p-mTOR/mTOR蛋白比值升高(均P<0.05)。与HIRI组比较，HIRI+AICAR组大鼠血清中ALT、AST水平及肝组织中MDA、ROS水平降低，SOD和ATP水平升高(均P<0.05);同时，肝组织中mtDNA拷贝数、线粒体膜电位及PGC-1α、NRF1、TFAM、UQCRC2 mRNA表达水平升高，p-AMPKα/AMPKα蛋白比值和PGC-1α、TFAM蛋白表达水平升高，p-mTOR/mTOR蛋白比值降低(均P<0.05)。联合SR-18292干预可明显逆转AICAR对HIRI大鼠肝组织的保护作用。结论 PGC-1α介导的线粒体生物合成参与调节AMPK激动剂介导的HIRI保护作用，其作用机制可能与激活AMPK/mTOR信号通路有关。
25-羟基胆固醇参与小鼠炎症性肠病的机制
李雨桐;罗小琦;谭启发;陈明杰;吴长有;沈娟;目的 探讨25-羟基胆固醇(25-HC)在小鼠炎症性肠病(IBD)发生发展中的作用及其机制。方法 全部小鼠分为三组：对照组正常喂养；DSS组用2.5%葡聚糖硫酸钠(DSS)溶液喂养；DSS+25-HC组用2.5%DSS溶液喂养，且腹腔注射25-HC溶液。通过评估小鼠的疾病活动指数判断小鼠的症状变化，通过组织学评分判断小鼠的组织改变并利用Western blot、qRT-PCR、免疫组化、流式细胞术等检测小鼠白细胞介素-17(IL-17)的表达情况及信号通路，并结合小鼠肠上皮紧密连接蛋白的检测，探究25-HC影响小鼠IBD的机制。结果 与DSS组比较，DSS+25-HC组小鼠体质量减轻(F=30.1,P<0.000 1),结肠缩短(F=63.8,P<0.05),疾病活动指数(F=774.5,P<0.000 1)和组织病理学评分升高(F=141.5,P<0.05),紧密连接相关蛋白(ZO-2、Occludin、JAM和Claudin-4)表达显著降低，IL-17水平显著降低，且表达水平与紧密连接蛋白呈正相关。结论 25-HC通过RORγt通路抑制结肠γδT细胞IL-17的产生，加重黏膜损伤，促进小鼠IBD发展。
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