基于iTRAQ技术探究过表达Ptpn2对SiO2介导的小鼠肺泡巨噬细胞炎症反应的调控作用
魏懿;李雅倩;李欣杰;冯梦斐;靳馥宇;徐洪;朱莹;目的 探究过表达非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶2(Ptpn2)对SiO2介导的小鼠肺泡巨噬细胞(MH-S)炎症反应的调控作用。方法 构建过表达Ptpn2稳转细胞系，给予SiO2诱导，分为空载对照组(NC)、过表达Ptpn2组(P)、空载对照+SiO2诱导组(NS)、过表达Ptpn2+SiO2诱导组(PS)；对4组细胞进行同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术联合液相色谱-串联质谱(LCMS/MS)技术分析，筛选差异蛋白，进行数据库基因本体(GO)和京都基因和基因组百科全书(KEGG)分析；采用免疫荧光染色检测肿瘤坏死因子(TNF)-α、气孔形成蛋白D(GSDMD)和转化生长因子(TGF)-β1的表达；Western blot检测PTPN2、Toll样受体(TLR4)、TNF-α、核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白(NLRP3)和TGF-β1信号通路相关的蛋白表达水平。结果 iTRAQ结果显示，4组共有144个差异蛋白；GO结果显示，差异蛋白在生物学过程主要富集在IκB激酶/核因子κB(NF-κB)信号传导、免疫反应的细胞激活和信号传导及转录激活蛋白(STAT)对受体信号通路的调节等；KEGG结果显示差异蛋白主要富集在Toll样受体信号通路、NF-κB信号通路、NOD样受体信号通路、TGF-β信号通路和TNF信号通路。免疫荧光染色结果显示，与NC组比较，NS组细胞中TNF-α、GSDMD和TGF-β1的表达增多(P<0.05)；而与NS组比较，PS组细胞蛋白中上述蛋白表达减少(P<0.05)。Western blot结果显示，与NC组比较，NS组细胞蛋白中PTPN2、p-NF-κB、MyD88、TLR4、NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-1β、TGF-βR1、TGF-βR2、p-Smad2/3蛋白表达水平显著上调(P<0.05)；而与NS组比较，PS组细胞蛋白中上述蛋白表达水平显著下调(P<0.05)。结论 过表达Ptpn2能够抑制SiO2介导的MH-S细胞中与炎症反应密切相关的TLR4-TNF-α信号、NLRP3信号和TGF-β1信号的蛋白表达。
LINC02086通过调控Wnt/β-catenin通路介导巨噬细胞M2极化对胃癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响
李军;卜亚飞;陈杰;丁波;王磊;目的 探讨长链间隔非编码RNA02086(LINC02086)过表达介导的巨噬细胞极化对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及机制。方法 采用qRT-PCR检测人胃黏膜上皮细胞GES-1及人胃癌细胞系HCG-27、NCI-N87、AGS中的LINC02086表达水平。使用佛波酯（PMA）将人急性单核细胞白血病细胞（THP-1）诱导分化为M0型巨噬细胞，分别用LINC02086过表达慢病毒（OE-LINC02086）及其阴性对照慢病毒（Vector）感染HGC-27细胞，收集培养上清液作为条件培养基1(CM1)；将M0型巨噬细胞与感染后的HGC-27细胞共培养，收集培养上清液得到CM2。使用CM1单独或联合Wnt/β-catenin通路抑制剂（IWR-1）处理M0型巨噬细胞，分别设为Vector+CM1组、OE-LINC02086+CM1组和OE-LINC02086+CM1+IWR-1组；通过流式细胞术检测细胞中甘露糖受体（CD206）水平；qRT-PCR检测细胞中白细胞介素-10(IL-10)、转化生长因子-β(TGF-β)、血管内皮生长因子（VEGF）和趋化因子配体22(CCL22)mRNA表达水平；Western blot检测细胞中CD206、VEGF蛋白和Wnt/β-catenin通路相关蛋白Wnt家族成员3a(Wnt3a)、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、β-连环蛋白（β-catenin）表达水平。使用CM2单独或联合IWR-1处理HGC-27细胞，分别设为Vector+CM2组、OE-LINC02086+CM2组和OE-LINC02086+CM2+IWR-1组；CCK-8法检测细胞增殖活性；Transwell检测细胞迁移、侵袭能力。结果 与GES-1细胞比较，HCG-27、NCI-N87及AGS细胞中LINC02086表达水平均升高（P<0.05），其中HCG-27细胞升高幅度最小。与Vector+CM1组比较，OE-LINC02086+CM1刺激后，巨噬细胞中CD206水平以及IL-10、TGF-β、VEGF和CCL22 mRNA表达水平升高（P<0.05），同时，细胞中Wnt3a和β-catenin蛋白表达水平升高（P<0.05）,GSK-3β蛋白表达水平降低（P<0.05）；然而，IWR-1联合干预可明显逆转LINC02086过表达对巨噬细胞CD206和IL-10、TGF-β mRNA等M2型极化标志物表达的促进作用（P<0.05）以及对Wnt/β-catenin通路的激活作用（P<0.05）。与Vector+CM2组比较，OELINC02086+CM2处理后，HGC-27细胞增殖活性及迁移、侵袭细胞数量升高（P<0.05）；然而，IWR-1联合干预可明显逆转LINC02086过表达对HGC-27细胞增殖、迁移和侵袭的促进作用（P<0.05）。结论 LINC02086过表达可通过激活Wnt/β-catenin通路介导巨噬细胞M2极化并促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭。
DPP7蛋白对肝细胞癌的影响及其机制
汪碧君;崔浩东;吴文涌;目的 探究二肽基肽酶7(DPP7)在肝细胞癌中的发生发展机制。方法 通过UALCAN及GEPIA数据库、免疫组织化学染色法和Western cblot实验检测肝癌组织及肝脏正常组织中DPP7蛋白表达情况并分析其临床病理特征之间的关系；选用siRNA沉默DPP7的表达，并通过Western blot、qRT-PCR法检测肝癌细胞MHCC97H中DPP7表达量；使用四唑盐比色法（MTT）、克隆形成及划痕愈合实验检测细胞增殖情况；Transwell法检测细胞的侵袭、迁移能力；通过Western blot检测上皮间充质转化（EMT）相关蛋白标志物的变化情况。结果 UALCAN、GEPIA数据库及临床肝癌组织样本中，DPP7蛋白表达上调，且与肝癌患者的TNM分期（P=0.002）、淋巴结转移（P=0.038）及肿瘤浸润深度（P=0.027）密切相关；实验组转染siRNA后，MHCC97H细胞株中的DPP7蛋白及mRNA表达量下调（P<0.01），且MTT法、克隆形成实验、划痕实验、Transwell法结果显示，MHCC97H细胞株的增殖和转移能力受到抑制；EMT相关蛋白检测显示上皮细胞标志物E-cadherin表达增加（P<0.001），而间充质标志物Vimentin、N-cadherin表达下降（P<0.01）。且MTT法、克隆形成实验、划痕实验、Transwell法结果显示：敲低MHCC97H细胞株的DPP7表达后，细胞的增殖和转移能力受到抑制；EMT相关蛋白检测显示上皮细胞标志物E-cadherin表达增加（P<0.001），而间充质标志物Vimentin、N-cadherin表达下降（P<0.01）。结论 DPP7在肝细胞癌组织和肝癌细胞株中呈高表达并与患者不良预后相关，下调DPP7蛋白表达可抑制肝癌细胞株MHCC97H的增殖、转移能力，其作用机制与EMT密切相关。
Lck/Yes相关新型酪氨酸激酶在巨噬细胞M1极化中的作用及机制研究
于欣;高振盛;卞伟华;刘向勇;孙业盈;目的 探讨Lck/Yes相关新型酪氨酸激酶(Lyn)对脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞M1型极化的作用及机制。方法 使用BSMBI-V2限制性内切酶酶切LentiCRISPR-V2质粒，回收酶切后的DNA片段，用T4连接酶连接酶切质粒与Lyn-sgRNA，制备Lenti-Lyn-gRNA慢病毒，用Lenti-Lyn-gRNA慢病毒感染THP-1细胞获得敲除Lyn基因的THP-1稳转株，得到完全敲除Lyn的THP-1单克隆细胞株(Lyn-/-)。采用100 ng/mL佛波酯(PMA)诱导Lyn野生型(LynWT)和Lyn-/- THP-1细胞48 h分化为M0巨噬细胞，用100 ng/mL LPS诱导M0巨噬细胞24 h极化为M1巨噬细胞。通过荧光实时定量PCR(qPCR)检测M0巨噬细胞标志物整合素αM(CD11b)、巨噬细胞抗原CD68和单核细胞分化抗原CD14的表达。qPCR检测野生型THP-1细胞分化的M1巨噬细胞(LynWT-M1)中Lyn表达，Western blot检测LynWT-M1细胞中磷酸化Lyn(P-Lyn)/Lyn。qPCR检测野生型敲除Lyn基因的THP-1细胞分化的M1巨噬细胞(Lyn-/--M1)一氧化氮合酶(iNOS)、白介素(IL)-6和趋化因子-10(CXCL-10)mRNA表达；Western blot检测iNOS蛋白表达及Janus激酶1(JAK1)-信号转录与转录激活因子1(STAT1)信号通路相关分子JAK1、磷酸化JAK1(PJAK1)和STAT1、磷酸化STAT1(P-STAT1)的蛋白表达。流式细胞术检测M1巨噬细胞标志物抗原分化簇80(CD80)的表达。结果 成功构建Lyn-/-单克隆细胞株。Lyn-/--M0巨噬细胞CD11b表达量明显升高(P<0.000 1)，表明M1巨噬细胞分化成功。分化为M1巨噬细胞后Lyn的mRNA和蛋白表达升高(P<0.05),Lyn促进M1巨噬细胞的极化。敲除Lyn抑制M1巨噬细胞iNOS、IL-6、CXCL-10的mRNA表达、iNOS的蛋白表达和CD80的表达(P<0.05)。Western blot检测结果显示Lyn敲除后抑制M1巨噬细胞JAK1和P-STAT1的蛋白表达(P<0.01)。结论 CRISPR/Cas9敲除Lyn后，M1巨噬细胞JAK/STAT信号通路中的关键分子JAK1与P-STAT1表达水平显著下调的同时，M1巨噬细胞特异性分泌因子iNOS、IL-6、CXCL-10 mRNA及CD80表达也下调，可能是通过靶向调控JAK1/P-STAT1介导的JAK/STAT信号通路来实现的。
miR-21靶向抑制PTEN/AKT/mTOR通路改善小鼠慢性肾纤维化的机制研究
祁娇;许珊珊;其其格;孟彦;赵建荣;张丽英;目的 研究miR-21靶向调节磷酸酶与张力蛋白同源物(PTEN)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路改善小鼠慢性肾纤维化的机制。方法 32只慢性肾病模型小鼠随机分为模型组、miR-21过表达组、miR-21抑制组、miR-21抑制+MK-2206组各8只，将8只健康小鼠纳入对照组。miR-21过表达组、miR-21抑制组、miR-21抑制+MK-2206组尾静脉注射慢病毒(50μL，每只1×108 TU)，每周1次，连续3周。对照组、模型组注射等量空载体(LV-NC)。miR-21抑制+MK-2206组同时另灌胃AKT/mTOR通路抑制剂MK-2206 480 mg/kg，每周1次，连续3周。比较各组miR-21表达、24 h尿蛋白定量、血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)，肾组织I型胶原蛋白(Collagen I)、Ⅲ型胶原蛋白(CollagenⅢ)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、PTEN蛋白表达及p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR;HE染色观察肾组织病理改变，Masson染色观察肾组织纤维化程度；双荧光素酶实验验证miR-21与PTEN的靶向关系。结果 与模型组比较，miR-21过表达组肾组织miR-21表达升高(P<0.05),miR-21抑制组肾组织miR-21表达降低(P<0.05)。与模型组比较，miR-21过表达组24 h尿蛋白定量、Scr、BUN，肾组织Collagen I、CollagenⅢ、α-SMA蛋白表达均升高(P<0.05)，而miR-21抑制组均降低(P<0.05)；与miR-21抑制组比较，miR-21抑制+MK-2206组24 h尿蛋白定量、Scr、BUN，肾组织Collagen I、CollagenⅢ、α-SMA蛋白表达均降低(P<0.05)。与模型组比较，miR-21过表达组PTEN蛋白表达降低(P<0.05),p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR升高(P<0.05);miR-21抑制组PTEN蛋白表达升高(P<0.05),p-AKT/AKT、pmTOR/mTOR均降低(P<0.05)；与miR-21抑制组比较，miR-21抑制+MK-2206组p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR均降低(P<0.05),PTEN蛋白表达差异无统计学意义。HE和Masson染色显示，对照组肾脏结构正常，几乎无纤维化；模型组出现肾小球增大、毛细血管袢粘连及局灶性纤维化；miR-21过表达组肾小球结构严重破坏，伴广泛纤维化和肾小管萎缩；miR-21抑制组病理变化和纤维化程度减轻；而miR-21抑制+MK-2206组仅见轻微病理改变和轻度纤维化，间质基本正常。与PTEN-WT+NC mimics组比较，PTEN-WT+miR-21 mimics组相对荧光素酶活性降低(P<0.001),PTEN-WT+NC mimics组和PTEN-MUT+miR-21 mimics组相对荧光素酶活性差异无统计学意义。结论 miR-21可能通过靶向调控PTEN进而抑制AKT/mTOR通路改善慢性肾病小鼠肾功能指标，减轻肾纤维化程度。
α-酮戊二酸经PI3K/AKT改善砷诱导的子代肝脂质沉积
暴双蕊;吴红艳;孙影;詹童;杨倩;梁心茹;万志雁;陈文一;张程;目的 探讨α-酮戊二酸(α-KG)对孕期砷暴露导致子代肝脏脂质沉积中的保护作用及机制。方法 SPF级8周龄癌症研究所(ICR)小鼠，雌雄2∶1交配后得到孕鼠共32只，将孕鼠随机分为4组：对照组、砷组、α-KG组、砷+α-KG组。在妊娠第0～16天(GD0～GD16)，砷组和砷+α-KG组每天饮水暴露亚砷酸钠(NaAsO2)15 mg/L,α-KG组和砷+α-KG组使用α-KG(2 g/kg)每天进行灌胃。在GD16收集胎鼠肝脏，并测量胎鼠体质量与顶臀长；转录组分析对照组和砷组基因表达差异；液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)检测胎鼠肝脏总三酰甘油(TGs)水平及其亚型；油红O染色观察肝脏组织病理变化；实时定量聚合酶链式反应(qPCR)检测胎鼠磷酸肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、脂质代谢相关基因的表达水平。结果 转录组学分析显示，孕期砷暴露后导致胎肝2 144个基因下调和1 675个基因上调；与对照组相比，砷组胎鼠体质量和顶臀长降低(PTuKey<0.05)，肝脏TGs水平升高(PTuKey<0.05)；油红O染色结果显示，脂滴明显增加(PTuKey<0.01);qPCR检测结果显示脂质合成相关基因表达显著上调(PTuKey<0.05),β-氧化以及脂质降解相关基因表达下降(PTuKey<0.05),PI3K、AKT转录水平降低(PTuKey<0.05)。与砷组相比，砷+α-KG组胎鼠体质量和顶臀长增加(PTuKey<0.05)；肝脏TGs水平降低(PTuKey<0.05)；油红O染色结果显示，脂滴显著减少(PTuKey<0.01)；脂质合成相关基因表达下调(PTuKey<0.05),β-氧化以及脂质降解相关基因表达上调(PTuKey<0.05),PI3K、AKT转录水平上升(PTuKey<0.05)。结论 α-KG可有效缓解孕期砷暴露导致的子代肝脏脂质沉积，其作用机制可能是通过激活PI3K/AKT，恢复脂质代谢稳态实现的。
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