Csf1rCre介导的黄色荧光素蛋白可有效标记各组织定居巨噬细胞
李晓宇;赵殿元;张胜权;杨靖;唐丽;目的 构建Csf1rCreRosa26YFP报告基因小鼠，检测Csf1rCre介导黄色荧光素蛋白(YFP)标记单核细胞及不同组织定居巨噬细胞的效率。方法 Rosa26YFP突变小鼠具有一个lox P侧翼的STOP序列，后跟插入Rosa26基因座的黄色荧光蛋白基因(YFP)。当与表达Csf1rCre重组酶的小鼠交配时，STOP序列被删除，并在双突变后代Csf1rCreRosa26YFP的表达组织中观察到YFP表达。将Csf1rCre小鼠与Rosa26YFP小鼠交配，通过PCR筛选出Csf1rCreRosa26YFP报告基因小鼠。分离成年Csf1rCreRosa26YFP小鼠的血液及骨髓单核细胞、肝脏巨噬细胞、肾脏巨噬细胞、肺泡巨噬细胞和脾脏巨噬细胞，标记流式抗体，通过流式细胞术分析Csf1rCre介导YFP标记组织巨噬细胞的效率。结果 Csf1rCreRosa26YFP报告基因小鼠中肾脏、肝脏、脾脏、肺泡巨噬细胞表达YFP中位数为93.25%、92.45%、91.10%、94.70%，血液单核细胞表达YFP中位数为98.20%，骨髓单核细胞表达YFP中位数为93.90%。结论 Csf1rCre可以介导YFP对各组织定居巨噬细胞以及骨髓和血液单核细胞进行示踪。同时，Csf1rCre可用作这些细胞的基因条件性敲除工具鼠。
淫羊藿苷下调TGF-β/Smad信号通路抑制三阴性乳腺癌侵袭转移
肖增友;杨泽安;陈彩红;李佳贤;何钰洁;付品婷;王杰;目的 探讨淫羊藿苷(ICA)下调转化生长因子-β/Smad(TGF-β/Smad)信号通路抑制人三阴性乳腺癌(TNBC)细胞侵袭转移的作用机制。方法 体外培养TNBC细胞(MDA-MB-231和MDA-MB-468)，分为4组，加入ICA(15μmol/L)设为实验组;加入10μmol/L TGF-β受体抑制剂LY2109761设为模型组;在模型组基础上，加入15μmol/L ICA设为LY2109761+ICA组;另设对照组。CCK-8、平板克隆、5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷(Ed U)、细胞划痕实验和Transwell实验检测细胞增殖、迁移和侵袭能力;免疫荧光和Western blot实验检测上皮-间质转化(EMT)相关蛋白以及转化生长因子β1(TGF-β1)、Smad2和磷酸化Smad2(P-Smad2)通路蛋白表达水平。结果 CCK-8结果显示随着ICA浓度增加，细胞的增殖能力逐渐减弱(P<0.001)。平板克隆与Ed U法结果显示，与对照组相比，实验组细胞增殖能力减弱(P<0.05)。划痕实验和Transwell实验显示，与对照组相比，实验组细胞迁移和侵袭能力下降(P<0.05)。与模型组相比，LY2109761+ICA组细胞侵袭能力进一步下降(P<0.05)。免疫荧光结果显示，与对照组相比，实验组细胞波形蛋白(Vimentin)表达下降(P<0.05)。与模型组相比，LY2109761+ICA组细胞Vimentin蛋白表达进一步下降(P<0.01)。Western blot结果显示，与对照组相比，实验组细胞神经钙黏蛋白(N-cadherin)、基质金属蛋白酶-9(MMP9 )、Vimentin以及TGF-β1、Smad2、P-Smad2蛋白表达量下降(P<0.05 )。与模型组相比，LY2109761+ICA组细胞N-cadherin、MMP9、Vimentin以及TGF-β1、Smad2、P-Smad2蛋白表达量进一步下降(P<0.05)。结论 ICA通过下调TGF-β/Smad信号通路抑制TNBC细胞增殖、侵袭转移和EMT。
重组人凝血因子X在HEK293细胞中的表达及活性检测
冯佳宁;邹森;赵泽林;李肖肖;张志斐;杨兆勇;目的 瞬时转染重组人凝血因子X(rhFX)到HEK293细胞，优化转染条件，体外构建高效表达rhFX的方法，检测rhFX活性。方法 pc DNA3.1-EGFP与F10基因构建真核表达载体pc DNA3.1-EGFP-FX并转染HEK293细胞，验证转染系统的有效性。pc DNA3.1与F10基因片段构建重组表达载体pc DNA3.1-FX，脂质体方法转染HEK293细胞，Western blot和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测细胞上清液中rhFX的表达。优化转染条件，ELISA测定rhFX的浓度;凝血酶原时间(PT)和发色底物法测定rhFX凝血生物活性。结果 在HEK293细胞上清液中成功表达rhFX。在细胞密度80%，质粒DNA与聚乙烯亚胺(PEI)的比例为1∶2，转染后第3天，rhFX表达量最高。ELISA检测3次上清液表达量最高为5.20 ng/mL。与对照组pc DNA3.1空载体转染收集的上清液相比，实验组rhFX的PT时间更短(P<0.000 1)，基于rhFX的发色底物法测得依度沙班的半数抑制浓度(IC50)为1.449 nmol/L，与文献报导的0.78 nmol/L处于同一数量级。结论 使用HEK293细胞成功表达出具有生物活性的rhFX蛋白，为进一步推动rhFX药物的研发奠定基础。
Tmem121肝细胞特异性敲除小鼠模型的建立与鉴定
王月;何国良;李兰玉;吴倩;周军媚;目的 建立并鉴定跨膜蛋白121(Tmem121)肝细胞特异性基因敲除小鼠。方法 利用CRISPR/Cas9与Cre-loxp系统构建Tmem121flox/+/Cre+与Tmem121flox/flox小鼠，再将两种小鼠进行杂交繁育获得后代小鼠。提取后代小鼠的鼠尾DNA，通过PCR鉴定小鼠基因型，获得肝细胞特异性Tmem121基因敲除小鼠(Tmem121flox/flox/Cre+,Tmem121ΔHep)。观察并分析敲除小鼠与对照小鼠的生长繁殖及器官发育情况。利用PCR及Western blot法验证Tmem121在小鼠原代肝细胞中敲除效率。利用Cell MaskTM深红质膜染色法比较对照组小鼠与敲除组小鼠原代肝细胞的形态差异并进行统计学分析。结果 通过小鼠基因型鉴定，成功获得Tmem121flox/flox/Cre+小鼠。敲除小鼠与对照小鼠在体质量、繁殖能力及肝脏的生长发育方面均无明显差异。肝细胞特异性敲除Tmem121基因对肝组织形态结构及病理特征无明显影响。与对照组相比，敲除组小鼠原代肝细胞Tmem121在mRNA及蛋白水平均明显降低(P<0.01)。Cell MaskTM深红质膜染色结果显示Tmem121敲除组小鼠的原代肝细胞的双核比例增多(P<0.05)，细胞表面积减小(P<0.001)。结论 成功建立Tmem121肝细胞特异性基因敲除小鼠模型，为进一步研究Tmem121基因在肝脏疾病中的作用及机制提供了动物模型支持。
BMP-2基因修饰的骨髓间充质干细胞复合纳米羟基磷灰石/聚酰胺66植入体改善大鼠萎缩性骨不连
黄永;马建文;李玉;景青玲;张钦;李长帅;目的 探究骨形态发生蛋白(BMP)-2基因修饰的骨髓间充质干细胞(BMSCs)复合纳米羟基磷灰石(n HA)/聚酰胺66(PA66)对大鼠股骨骨不连的治疗作用。方法 分离大鼠BMSCs，并分为支架(sent)+BMSCs组、sent+BMSCs+rh BMP-2组、sent+BMSCs+Ad-BMP-2组;将人重组BMP-2(rh BMP-2)或腺病毒感染BMP-2(Ad-BMP-2)载体转染BMSCs并装载n HA/PA66支架材料。流式细胞仪检测BMSCs表达特定表面标志物，通过MTT法检测细胞增殖情况，ELISA检测相关生物活性因子，包括血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子-β(TGF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨钙素(OCN)、骨连接蛋白(ON)，碱性磷酸酶(ALP)。扫描电子显微镜(SEM)观察细胞生长和黏附情况。在SD大鼠的萎缩性骨不连模型中，将sent+BMSCs+rh BMP-2或sent+BMSCs+Ad-BMP-2复合体植入缺损区域，分为rh BMP-2组及Ad-BMP-2组，并通过X射线和MicroCT评估治疗效果。结果 n HA/PA66支架表面光滑且多孔，BMSCs良好黏附。流式细胞术显示在BMSCs中高表达CD29和CD90，低表达CD45和CD34。MTT显示细胞在72 h后迅速增殖。与sent+BMSCs组及sent+BMSCs+rhBMP-2组相比，sent+BMSCs+Ad-BMP-2组ALP活性、PDGF、TGF-β、VEGF、FGF、OCN、ON表达均上调(P<0.05)。术后12周Ad-BMP-2组大鼠支架复合物已完全被新生皮质骨包裹，且表面光滑完整。X射线显示Ad-BMP-2组复合物已完全被新生皮质骨包裹，恢复程度优于rh BMP-2组。MicroCT结果显示，与rh BMP-2组相比，Ad-BMP-2组术后12周大鼠骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数目、骨矿物质密度及骨矿物质含量均升高(P<0.05)，骨小梁分离水平降低(P<0.05)。结论 Ad-BMP-2转染BMSCs复合n HA/PA66支架材料可以更有效地表达生物活性，为BMSCs提供持续和良好的增殖分化微环境，有利于促进局部成骨活性，且有利于骨缺损修复。
瑞芬太尼对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、凋亡及Wnt/β-catenin通路的影响
张杨;刘文文;苗欢欢;杨光;目的 探讨瑞芬太尼对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、凋亡及Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)通路的影响。方法 用不同浓度瑞芬太尼(0、0.5、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0μg/mL)处理人正常乳腺MCF-10A细胞和乳腺癌MDA-MB-231细胞筛选瑞芬太尼的实验浓度。将MDA-MB-231细胞分为对照组、瑞芬太尼低(5.0μg/mL)、中(10.0μg/mL)、高(20.0μg/mL)浓度组、瑞芬太尼+SKL2001(Wnt/β-catenin通路激动剂)组; MTT实验和集落形成实验检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期变化; Western blot检测细胞增殖、凋亡和Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达。结果 5.0、10.0、20.0μg/mL瑞芬太尼可降低MDA-MB-231细胞活力，并对MCF-10A细胞无明显毒性。与对照组相比，瑞芬太尼低、中、高浓度组细胞增殖的光密度值、集落形成数、S期细胞比例、细胞髓细胞瘤病基因(c-Myc)、细胞周期素D1、B淋巴细胞瘤2(Bcl-2)、半胱天冬氨酸蛋白酶3前体(pro-caspase-3)、β-catenin蛋白水平降低(P<0.05),G0/G1期细胞比例、细胞凋亡率、早期凋亡率、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和激活型半胱天冬氨酸蛋白酶3(Cleaved caspase-3)、糖原合酶激酶3β(GSK-3β)蛋白水平增加(P<0.05);SKL2001可削弱瑞芬太尼对MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的影响。结论 瑞芬太尼可抑制MDA-MB-231细胞增殖，诱导细胞凋亡和细胞周期停滞，其机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路激活有关。
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