红景天仿生纳米药物对急性胰腺炎大鼠的胰腺保护作用及其机制
张彤哲;赵喜容;李培武;目的 探究红景天(Rho)的仿生纳米药物在急性胰腺炎大鼠中的胰腺保护作用及其机制。方法 以红细胞膜囊泡(EMV)作为仿生纳米药物包裹材料,构建红景天仿生纳米药物,同时构建急性胰腺炎大鼠模型并分为急性胰腺炎模型(AP)组、Rho组、EMV组、Rho的EMV仿生纳米药物(R-EMV)组。对R-EMV组大鼠进一步使用NLRP3激活剂BMS-986299(R-EMV+BMS-986299组)和抑制剂MCC950(R-EMV+MCC950组)干预。观察大鼠腹水量变化,并采用酶联免疫吸附试验检测血清白细胞介素(IL)-6、IL-1β、内皮素(ET)、二胺氧化酶(DAO)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)水平;苏木精-伊红(HE)染色法观察胰腺组织病理变化;免疫组化、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白质印迹(Western blot)分析胰腺组织NOD样受体蛋白3(NLRP3)、核转录因子-kappa B(NF-κB)表达水平。结果 制备的R-EMVs呈近圆形,平均粒径为(244.61±1.08)nm, Zeta电位为-(11.13±1.25) mV;同时,EMV可以负载(58.67±0.79)μg的Rho。与Sham组比较,AP组大鼠腹水量较高(t=33.79,P<0.01),外周血免疫指标IL-1β、IL-6、ET、DAO水平升高(t=38.25、42.54、29.20、34.92,均P<0.01),AP组可见明显组织充血水肿、小叶间隙增宽,大量炎症细胞浸润,胰腺病理评分升高(t=30.06,P<0.01)。与AP组比较,Rho组腹水量、胰腺干湿重比、病理评分、淀粉酶、脂肪酶水平均下降(F=1 523.7、543.3、839.9、446.1、172.2,P<0.05);与其他组相比,AP组血清IL-1β、IL-6、ET、DAO水平均出现一定程度的降低。与AP组相比,R-EMV组中NF-κB p65、NLRP3蛋白水平降低,NF-κB、NLRP3免疫组化染色评分降低(t=24.54、26.91,均P<0.001)。同时,R-EMV+MCC950组中的血清IL-1β、IL-6、ET、DAO、MDA、SOD、GSH水平较AP组、R-EMV组、R-EMV+BMS-986299组呈现明显低表达状态。结论 R-EMV在急性胰腺炎中具有较好的胰腺保护作用,其机制与降低NF-κB/NLRP3通路活性并下调IL-6等炎症因子和MDA等氧化应激指标的表达有关。
改良组织块培养法提取原代大鼠脑微血管内皮细胞及鉴定
张帆;李柏霖;池茗;刘海琴;唐元瑜;目的 探究脑微血管组织块培养法提取原代大鼠脑微血管内皮细胞并对其进行鉴定。方法 取4周龄SD大鼠脑皮层,经过筛网、预消化、微血管组织块固化处理后,置于CO_2培养箱中进行原代培养。通过细胞形态学观察、第Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学染色法鉴定所培养的目的细胞。结果 体外培养48 h后短梭形细胞从脑微血管段周围爬出;72 h后岛屿状的细胞团簇形成;96 h后团簇融合,细胞呈典型的单层铺路石样镶嵌式排列生长。第Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学染色法检测显示,细胞胞质呈棕红色,表达为阳性,细胞核被苏木精衬染成蓝黑色。结论 脑微血管组织块培养法能够成功提取原代大鼠脑微血管内皮细胞。
爱拉斯汀对急性髓系白血病细胞铁死亡的影响及其相关作用机制
江贤栋;黄莹莹;洪小颖;林昕迪;林东红;林梨平;目的 探讨溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3(LPCAT3)在爱拉斯汀(Erastin)诱导急性髓系白血病(AML)细胞铁死亡中的作用及其相关分子调控机制。方法 四唑盐(MTS)法检测不同AML细胞对铁死亡经典诱导剂Erastin的敏感性,实时荧光定量PCR(qPCR)检测其LPCAT3 mRNA的基础表达水平,分析二者关联性。构建慢病毒介导的LPCAT3过表达AML细胞株(OE组)及阴性对照株(NC组)。在Erastin干预后,采用MTS、流式细胞术及微量法分别检测细胞活力、脂质活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)。qPCR和Western blot检测未折叠蛋白反应(UPR)经典通路信号分子(PERK、ATF4、GRP78等)的表达水平。采用UPR抑制剂4-苯基丁酸(4-PBA)联合干预后检测上述铁死亡相关指标,分析调控关系。结果 4种不同AML细胞对铁死亡敏感性不同,其中K562细胞相对不敏感,4种AML细胞对Erastin的IC_(50)与LPCAT3表达水平呈负相关(r=-0.919,P<0.001)。Erastin干预后,与NC组相比,OE组K562细胞的细胞活力被Erastin抑制(P<0.001),脂质ROS与MDA水平增加(P<0.001);qPCR、Western blot检测结果显示,与NC组相比,OE组中UPR经典通路分子PERK、ATF4、GRP78 mRNA和蛋白表达均升高(P<0.01);通过4-PBA抑制UPR通路后,与未抑制状态相比,K562细胞活力下降(P<0.01),脂质ROS与MDA水平升高(P<0.01)。结论 过表达LPCAT3可促进K562细胞铁死亡,且其激活的UPR经典通路PERK/ATF负向调控该过程。
基于网络药理学和动物实验探讨葛根素治疗类风湿关节炎的作用机制
高月;唐芳;马武开;兰维娅;蒋总;金泽旭;目的 通过网络药理学和动物实验探讨葛根素治疗类风湿关节炎(RA)的作用机制。方法 使用中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)和SwissTargetPrediction数据库收集葛根素靶点,使用GeneCards、OMIM数据库获取RA的疾病相关靶点,利用Cytoscape 3.7.2软件建立蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络,通过Metascape数据库进行基因本体(GO)功能和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析;使用Ⅱ型胶原乳剂复制RA大鼠-胶原诱导型关节炎(CIA)模型,将49只Wistar大鼠随机分为空白对照(Con)组,CIA模型(CIA)组,低、中、高剂量葛根素(L-、M-、H-puerarin)组,甲氨蝶呤(MTX)组,雷公藤多苷片(TGT)组。除Con组外,其余各组大鼠制成CIA大鼠模型后连续灌胃28 d。观察各组大鼠后肢关节红肿情况及踝关节病理改变,Western blot检测滑膜糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)、β-连环蛋白(β-catenin)蛋白表达,qPCR检测滑膜GSK-3β、β-catenin、c-Myc mRNA表达。结果 获得134个葛根素作用靶点,RA疾病相关靶点基因5 821个,葛根素与RA交集靶点基因102个,涉及JAK-STAT、NF-κB、Wnt等184条信号通路。动物实验结果表明,M-puerarin和MTX干预后大鼠后足红肿症状改善并且关节滑膜中炎性细胞浸润明显减少,软骨及骨组织破坏程度减轻。与CIA组相比,M-puerarin干预后的大鼠滑膜组织中GSK-3β、β-catenin蛋白表达和GSK-3β、β-catenin、c-Myc mRNA表达均下降(P<0.05)。结论 葛根素可以通过多靶点、多途径协同治疗RA,可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路,缓解CIA大鼠滑膜增生,减轻关节软骨侵蚀及骨破坏情况。
参附注射液通过抑制铁死亡发挥对缺氧缺血性脑损伤的保护作用
张晓彤;张萌;李刚;胡阳;荀雅静;丁会;沈栋林;吴铭;目的 观察缺氧缺血时脑组织损伤情况及使用参附注射液(SFI)后的病理改变、铁死亡相关因子的表达,探讨SFI通过抑制铁死亡发挥对缺氧缺血性脑损伤(HIBD)的保护作用机制。方法 构建SD大鼠HIBD模型,并用SFI进行干预。HE染色观察脑组织病理改变;尼氏染色观察神经元存活情况;Western blot、免疫组织化学、免疫荧光法检测脑组织谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、二价金属离子转运蛋白1(DMT1)的表达;试剂盒检测还原型谷胱甘肽(GSH)、乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及组织铁含量。体外培养小鼠小胶质细胞系(BV2),分为对照(Ctrl)组、氧糖剥夺(OGD)组、铁死亡诱导(Erastin)组、铁死亡抑制(Fer-1)组、SFI组、Erastin+SFI组,2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)活性氧(ROS)荧光探针检测ROS释放水平;免疫荧光染色观察细胞内GPX4、DMT1表达。结果 与Sham组相比,HIBD组大鼠脑组织中出现明显的神经细胞受损,GPX4表达下降(P<0.01),DMT1表达升高(P<0.01),GSH与SOD含量下降(P<0.01),LDH、MDA及组织铁含量上升(P<0.05,P<0.05,P<0.01);而SFI干预后,与Sham组相比,GPX4表达升高(P<0.01),DMT1表达下降(P<0.01),GSH与SOD含量升高(P<0.01),LDH、MDA及组织铁含量降低(P<0.05,P<0.05,P<0.01)。BV2细胞实验显示:与Ctrl组相比,OGD组ROS含量明显升高且GPX4荧光强度表达明显下降、DMT1荧光强度上升(P<0.01);与OGD组相比,SFI组ROS含量降低,同时GPX4的表达升高,DMT1的表达降低(P<0.01)。结论 新生HIBD大鼠海马及皮质区损伤严重,GPX4表达下降、DMT1表达升高,提示铁死亡参与新生大鼠HIBD脑损伤,而SFI通过减少铁的聚集,减少ROS的产生,对HIBD实验动物模型和BV2细胞损伤模型具有保护作用。
LncRNA SFTA1P通过调控miR-182-5p/FN1通路促进肾透明细胞癌细胞增殖与迁移
向威;吕磊;郑福鑫;袁敬东;目的 探讨长链非编码RNA表面活性剂相关1假基因(SFTA1P)通过调控微小RNA-182-5p(miR-182-5p)/纤连蛋白1(FN1)通路促进肾透明细胞癌(ccRCC)细胞增殖与迁移的分子机制。方法 应用GEPIA2软件探究TCGA数据库中SFTA1P在ccRCC组织中的表达;实时定量PCR(qPCR)检测SFTA1P在ccRCC组织、正常肾脏组织及ccRCC细胞系中的表达;亚细胞定位实验探究SFTA1P在ccRCC细胞系人肾细胞腺癌细胞(ACHN)中的定位;将ACHN细胞分为si-Con组、si-SFTA1P#2组、mimic NC组、miR-182-5p mimic组、anti-miR-Con组、anti-miR-182-5p组、anti-miR-182-5p+si-FN1组、si-Con+anti-miR-Con组、si-SFTA1P#2+anti-miR-Con组及si-SFTA1P#2+anti-miR-182-5p组;CCK-8与transwell小室实验检测细胞增殖与迁移能力;qPCR、Western blot和双荧光素酶报告基因实验检测SFTA1P、miR-182-5p和FN1的调控关系。结果 TCGA数据库分析显示,SFTA1P在ccRCC组织中高表达(P<0.05);与正常肾脏组织比较,SFTA1P在ccRCC组织中表达升高(P<0.01);ccRCC细胞系786-O、SN12-PM6、ACHN及A498中SFTA1P表达明显高于人肾近曲小管细胞HK-2(均P<0.01);亚细胞定位实验显示SFTA1P主要分布于ACHN细胞的细胞质中;与si-Con组比较,si-SFTA1P#2组ACHN细胞增殖与迁移能力降低,FN1 mRNA及蛋白表达降低(P<0.05);与mimic NC组比较,miR-182-5p mimic组ACHN细胞FN1 mRNA及蛋白表达降低(P<0.01);与anti-miR-Con组比较,anti-miR-182-5p组ACHN细胞FN1 mRNA及蛋白表达增加,细胞增殖与迁移能力增强(P<0.05);与anti-miR-182-5p组相比,anti-miR-182-5p+si-FN1组ACHN细胞增殖与迁移能力降低(P<0.05);与si-SFTA1P#2+anti-miR-Con组比较,si-SFTA1P#2+anti-miR-182-5p组ACHN细胞增殖与迁移能力增强,FN1 mRNA及蛋白表达增加(P<0.05)。结论 SFTA1P在ccRCC中高表达,其通过调控miR-182-5p/FN1通路促进ccRCC细胞的增殖与迁移。
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